王 芳 房建成 許媛麗 李婷婷 劉紅星

(河北燕達(dá)陸道培醫(yī)院病理和檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)科,廊坊065201)

某個(gè)體或群體中，免疫球蛋白(Immunoglobulin,IG)和/或T細(xì)胞受體(T cell receptor,TCR)基因V區(qū)序列多樣性的集合稱為免疫組庫(kù)(Immune repertoire，IR)。理論上講每個(gè)人體內(nèi)可以有超過2×1012個(gè)可能的重排的IG和TCR序列，幾乎每個(gè)B/T細(xì)胞都有自己不同的IG/TCR序列，稱為序列多樣性[1]。但在抗感染、自身免疫病、實(shí)體腫瘤以及B/T細(xì)胞腫瘤時(shí)，由于反應(yīng)性或克隆性B/T細(xì)胞增殖，可導(dǎo)致IG/TCR序列多樣性減少。因此IR中IG/TCR基因序列多樣性反映了B/T細(xì)胞增殖克隆性和機(jī)體的免疫狀況，與B/T細(xì)胞腫瘤、其他實(shí)體腫瘤、自身免疫病和感染都密切相關(guān)[2]。

目前普遍采用多重PCR和毛細(xì)管電泳技術(shù)(Capillary electrophoresis，CE)對(duì)IR的多樣性進(jìn)行分析[3，4]。近年來(lái)新一代高通量測(cè)序(Next generation sequencing,NGS)技術(shù)的日漸成熟和推廣應(yīng)用，提供了接近成熟的技術(shù)基礎(chǔ)，促進(jìn)了IR分析的研究和應(yīng)用。IR分析本質(zhì)上是基于大數(shù)據(jù)量的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，目前分析結(jié)果多是將序列按照家族分類以柱狀圖的形式展示，缺乏量化的多樣性評(píng)價(jià)指標(biāo)。本研究以初診急性B淋巴細(xì)胞白血病(B cell acute lymphoblastic leukemia,B-ALL)和免疫球蛋白重鏈(Immunoglobulin heavy chain,IGH)基因?yàn)槔?，擬探討稀疏分析、Shannon-Wiener指數(shù)和Simpson指數(shù)三種統(tǒng)計(jì)學(xué)指標(biāo)在IR分析中的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料、試劑 隨機(jī)選取2015年11月至2017年12月經(jīng)CE檢測(cè)IGH基因重排克隆性分析結(jié)果為陽(yáng)性的36例初診B-ALL患者，以及經(jīng)CE檢測(cè)IGH基因重排克隆性分析結(jié)果為陰性的15例健康對(duì)照。男女比1.43∶1，年齡范圍3～53歲，中位年齡14歲。本研究經(jīng)過河北燕達(dá)陸道培醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，志愿者均簽署了知情同意書。

實(shí)驗(yàn)所用的主要儀器和試劑：血液基因組柱式小量提取試劑盒(蘇泰械備20140022號(hào)，江蘇康為世紀(jì)生物科技有限公司)； LymphoTrack IGH Assay-PGM試劑盒(美國(guó)Invivoscribe公司)； Ion Torrent PGM二代測(cè)序儀及配套試劑、AB 2720 PCR儀和7500熒光定量PCR儀均為美國(guó)Thermo Fisher公司產(chǎn)品；超微量紫外分光光度計(jì)Quawell Q5000(美國(guó)Quawell公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法 提取骨髓或外周血標(biāo)本中的基因組DNA并測(cè)量濃度。分別取50 ng DNA進(jìn)行IGH V區(qū)片段擴(kuò)增建庫(kù)，使用熒光定量PCR法對(duì)文庫(kù)定量，然后取合適濃度的文庫(kù)進(jìn)行NGS測(cè)序。所有操作均按照試劑和儀器的說明書進(jìn)行。

將Ion PGM上產(chǎn)生的FASTQ格式數(shù)據(jù)使用MiXCR軟件[5]進(jìn)行數(shù)據(jù)質(zhì)控、IGH序列的家族比對(duì)分析,采用稀疏分析、Shannon-Wiener指數(shù)(以Shannon-Wiener指數(shù)均值表示)、Simpson指數(shù)(以inverse Simpson指數(shù)均數(shù)表示)三種指標(biāo)進(jìn)行多樣性分析，并繪制稀疏曲線[6]。

2 結(jié)果

2.1CE和NGS測(cè)序結(jié)果 36例初診B-ALL患者的標(biāo)本IGH重排克隆性用CE法均檢測(cè)為陽(yáng)性，呈單克隆或雙克隆結(jié)果。15例健康個(gè)體對(duì)照標(biāo)本均為陰性，呈多克隆結(jié)果。每份標(biāo)本NGS測(cè)序所得到的可供分析的序列條數(shù)均>50 000，質(zhì)量≥Q20的堿基占比>90%。將51例標(biāo)本根據(jù)CE檢測(cè)IGH克隆性重排的結(jié)果分為兩組：陽(yáng)性(36例初診B-ALL患者P1-36，組1)和陰性(15例健康個(gè)體N1-15，組2)。

2.2兩組標(biāo)本在稀疏分析中繪制的稀疏曲線不同 稀疏分析根據(jù)隨機(jī)抽樣來(lái)計(jì)算抽樣所得到的序列中所觀察到的序列種類的數(shù)目，根據(jù)稀疏分析所繪制的稀疏曲線可以將不同組標(biāo)本的IGH基因IR多樣性可視化地展現(xiàn)出來(lái)，同時(shí)可以顯示該分析的隨機(jī)抽樣量是否充分。兩組標(biāo)本在稀疏分析中通過抽樣所觀察到的序列種類的數(shù)目有所差異(圖1)，組1中位數(shù)為75(33～215.5)，組2中位數(shù)為363(243.5～500.5)。以標(biāo)本N7和P31為例，N7的CE檢測(cè)IGH克隆性重排結(jié)果為陰性，IGH的三個(gè)范圍的擴(kuò)增片段均為高斯分布(圖2A)；而P31的CE檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，三個(gè)范圍的擴(kuò)增片段均只有一個(gè)片段，多樣性顯著減少(圖2B)。

兩份標(biāo)本NGS所得序列的稀疏曲線也有差異(圖2C)。在抽樣的序列數(shù)由0增加至5×104時(shí)，P31曲線上升較少，快速到達(dá)平臺(tái)期，縱坐標(biāo)顯示其序列種類較少；而N7曲線快速上升，縱坐標(biāo)顯示其在采樣很小的情況下序列多樣性即超過800，說明其序列多樣性顯著。在進(jìn)一步加大抽樣序列數(shù)的情況下，P31的曲線始終維持在平臺(tái)期，多樣性沒有增加，說明該標(biāo)本抽樣充分，多樣性較少；而N7通過數(shù)據(jù)外推所得擬合曲線仍然緩慢上升直至平臺(tái)期，說明其隨著抽樣序列數(shù)的增加，其多樣性仍在進(jìn)一步增加，同時(shí)由于擬合曲線只是反映根據(jù)實(shí)際數(shù)據(jù)外推所得到的假設(shè)數(shù)據(jù)，因此擬合曲線的出現(xiàn)也說明該標(biāo)本的采樣需要進(jìn)一步增加。但由于真實(shí)數(shù)據(jù)所得的稀疏曲線已經(jīng)可以表現(xiàn)為出現(xiàn)平臺(tái)期的趨勢(shì)，因此該例標(biāo)本的抽樣量被認(rèn)為可接受。

圖1 標(biāo)本多樣性Fig.1 Sample diversity Note: The horizontal represented the samples,the vertical represented the number of species that were sampled in every sample.Blue dots and red dots marked group 1 and group 2,respectively.

圖2 CE檢測(cè)結(jié)果及稀疏曲線Fig.2 CE testing results and rarefaction curvesNote: A and B were the CE testing results of IGH clonal rearrangement in Sample N7 and P31,respectively.C were the rarefaction curves of Sample N7 and P31,the horizontal “sample size” represented the number of reads randomly sampled from the sequenced reads in the analysis,and the vertical “Diversity” represented the number of species that were actually observed in a sample size.Solid and dashed lines marked interpolated and extrapolated regions of rarefaction curves respectively.Shaded areas marked 95% confidence intervals.

圖3 兩組標(biāo)本Shannon-Wiener指數(shù)和Simpson指數(shù)Fig.3 Shannon-Wiener Index and Simpson IndexNote: A and B were the mean values of Shannon-Wiener index and inverse Simpson index,respectively.The horizontal represented the samples,the vertical represented the index values.Blue dots and red dots marked group 1 and group 2,respectively.

2.3兩組標(biāo)本的Shannon-Wiener指數(shù)及Simpson指數(shù)不同 Shannon-Wiener指數(shù)和Simpson指數(shù)可以將IGH 基因序列多樣性進(jìn)行量化。兩組標(biāo)本的兩個(gè)指數(shù)均數(shù)均有差異(圖3)。組1(CE檢測(cè)IGH克隆性重排陽(yáng)性)中Shannon-Wiener指數(shù)均數(shù)中位數(shù)為2.78(1.95～3.83)，其中88.89%(32/36例)標(biāo)本Shannon-Wiener指數(shù)均數(shù)<10，而組2(CE檢測(cè)IGH克隆性重排陰性)中100%(15/15例)Shannon-Wiener指數(shù)均數(shù)>100(圖3A)，中位數(shù)為232.35(151.46～418.63)。Simpson指數(shù)的結(jié)果類似(圖3B)，組1中inverse Simpson指數(shù)均數(shù)中位數(shù)為2.01(1.58～2.64)，其中Shannon-Wiener指數(shù)均數(shù)<10的32例標(biāo)本inverse Simpson指數(shù)均數(shù)<3，組2中100%(15/15例)inverse Simpson指數(shù)均數(shù)>80，中位數(shù)為203.21(130.57～372.47)。

通過計(jì)算組1標(biāo)本NGS測(cè)序結(jié)果中每一份標(biāo)本前兩位的序列比例之和(以S表示)，可以發(fā)現(xiàn)，Shannon-Wiener指數(shù)均數(shù)<10的32例標(biāo)本S值的中位數(shù)為93.72%(85.49%～98.60%)，而Shannon-Wiener指數(shù)均數(shù) >10的4例標(biāo)本P21、P24、P29、P34的S值低于上述水平，分別為15.80%、15.70%、66.33%、50.58%。而在Simpson指數(shù)這個(gè)指標(biāo)中，僅P21、P24這兩例S值非常低的標(biāo)本inverse Simpson指數(shù)均數(shù)>5，而P29、P34這兩例標(biāo)本的inverse Simpson指數(shù)均數(shù)分別為4.29、4.27，接近其余32例標(biāo)本的指數(shù)均數(shù)水平(圖3B)。

3 討論

IR分析在感染、自身免疫病、實(shí)體腫瘤及B/T細(xì)胞腫瘤的診斷和鑒別診斷方面有廣泛且重要的潛在應(yīng)用價(jià)值。NGS由于測(cè)序原理的優(yōu)勢(shì)，能夠同時(shí)得到片段長(zhǎng)度和序列信息，為IR分析提供了較為理想的技術(shù)基礎(chǔ)，也是近年來(lái)分子醫(yī)學(xué)的研究熱點(diǎn)之一。近年來(lái)使用NGS 方法確定IG 基因序列多樣性的研究進(jìn)展迅速, 可用于對(duì)淋巴細(xì)胞組庫(kù)的組成進(jìn)行定性、疾病監(jiān)測(cè)、描述與疾病進(jìn)展和復(fù)發(fā)相關(guān)的惡性腫瘤細(xì)胞中的抗體演變和多樣化的程度、以及評(píng)估造血干細(xì)胞移植之后的免疫重建等方面[7-11]。但在IR分析時(shí)，一直缺乏較好的量化評(píng)價(jià)指標(biāo)。本文用IGH和初診的B-ALL為樣本，探討稀疏分析、Shannon-Wiener指數(shù)、Simpson指數(shù)三種指標(biāo)在IR分析中的應(yīng)用價(jià)值。

稀疏分析經(jīng)常被用于生物學(xué)中群落物種及微生物的多樣性分析[12,13]。其應(yīng)用的前提條件有采樣相對(duì)充分、均質(zhì)分布等[14]。而IR分析時(shí)，對(duì)B/T細(xì)胞的采樣，一般通過外周血采集，能夠滿足上述條件。因此稀疏分析可能也適用于IR多樣性的分析。本研究的結(jié)果也顯示可以通過稀疏曲線來(lái)可視化地展現(xiàn)不同標(biāo)本中IGH基因IR的多樣性。在圖1中可以看出兩組標(biāo)本多樣性的不同，但在組1中P36標(biāo)本的序列種類數(shù)目為2 002，遠(yuǎn)遠(yuǎn)偏離組1其余35例標(biāo)本的范圍，看起來(lái)IGH克隆性重排應(yīng)該為陰性，但是結(jié)合其優(yōu)勢(shì)克隆的比例(95.27%)以及Shannon-Wiener指數(shù)均數(shù)(1.32)與inverse Simpson指數(shù)均數(shù)(1.10)可以看出該標(biāo)本中有一個(gè)高比例的優(yōu)勢(shì)克隆，其IGH克隆性重排結(jié)果與CE檢測(cè)結(jié)果相符。因此對(duì)于標(biāo)本IGH重排克隆性的分析，不能簡(jiǎn)單依靠一個(gè)指標(biāo)來(lái)判斷，應(yīng)該結(jié)合多個(gè)指標(biāo)綜合分析。

Shannon-Wiener指數(shù)與Simpson指數(shù)是描述群落物種多樣性的兩種α多樣性指數(shù)，能夠?qū)θ郝湮锓N組成的豐富度及均勻度進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，是目前生態(tài)學(xué)中應(yīng)用最廣泛的兩個(gè)數(shù)量指標(biāo)[15]。正常情況下，不同的B細(xì)胞的IGH序列幾乎互不相同。一般認(rèn)為B細(xì)胞腫瘤起源于一個(gè)B細(xì)胞，所有的腫瘤細(xì)胞均應(yīng)該具有相同的IGH序列。因此，IGH序列多樣性可以反映不同B細(xì)胞組成的豐富度。在一定程度上Shannon-Wiener指數(shù)與Simpson指數(shù)可能也適用于對(duì)IGH序列多樣性的分析。本研究的結(jié)果顯示，Shannon-Wiener指數(shù)和Simpson指數(shù)可以對(duì)IG的多樣性進(jìn)行量化。組1和組2數(shù)據(jù)之間具有很大差異，在組1中，由于不同標(biāo)本中克隆細(xì)胞的比例不同，因此這兩個(gè)指數(shù)值會(huì)出現(xiàn)較大的差異。優(yōu)勢(shì)克隆所占比例高的標(biāo)本整體B細(xì)胞的多樣性自然會(huì)減少。本研究中出現(xiàn)的P21、P24、P29、P34這4例標(biāo)本中，由于P21、P24標(biāo)本中優(yōu)勢(shì)克隆所占比例很低(15.80%、15.70%)，因此Shannon-Wiener指數(shù)與Simpson指數(shù)值均高于組1的普遍水平；而P29、P34這2例標(biāo)本，其優(yōu)勢(shì)克隆所占比例雖然低于其余32例標(biāo)本，但比例也在50%以上，相對(duì)P21、P24來(lái)說多樣性相對(duì)少一些，因此Simpson指數(shù)值更接近于其余32例標(biāo)本，這也說明在豐富度不變的情況下，Simpson指數(shù)比Shannon-Wiener指數(shù)對(duì)均勻度更敏感，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致[14]。綜上所述,本研究初步顯示稀疏分析可以通過稀疏曲線可視化地展現(xiàn)IGH基因IR的多樣性,而Shannon-Wiener指數(shù) 與Simpson指數(shù)可以給出評(píng)價(jià)多樣性的部分量化指標(biāo),而對(duì)于IGH多樣性的分析不應(yīng)單獨(dú)應(yīng)用某一個(gè)指標(biāo)，應(yīng)綜合運(yùn)用多種指標(biāo)進(jìn)行更全面地判斷。