趙冬梅 耿旭景 譚 麗 張 丹 項(xiàng)云改 宋玉霞

(鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)研究部，鄭州450014)

子宮內(nèi)膜異位癥(Endometriosis，EMS)是一種常見的婦科疾病，通常表現(xiàn)為子宮腔外存在子宮內(nèi)膜細(xì)胞，子宮內(nèi)膜異位癥大大增加了醫(yī)療費(fèi)用，就美國而言每年高達(dá)220億美元[1]。子宮內(nèi)膜異位癥的癥狀差別很大，包括痛經(jīng)、性交痛、非循環(huán)性慢性盆腔疼痛以及不孕癥，嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量[2]。子宮內(nèi)膜異位癥大約影響5%的生育年齡婦女健康，常常伴隨著不孕和盆腔疼痛，其中高達(dá)50%的患者是不孕的[3]。手術(shù)切除異位病灶和/或激素抑制來減少雌激素的產(chǎn)生，是目前治療的金標(biāo)準(zhǔn)，然而上述方法常伴隨著各種副作用及高復(fù)發(fā)率[4]，因此，確定子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病機(jī)制和尋找新的治療策略至關(guān)重要。

研究發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜異位癥與機(jī)體免疫炎癥反應(yīng)有關(guān)，多種免疫因子、細(xì)胞因子、炎癥因子在子宮內(nèi)膜異位癥患者中異常表達(dá)[5,6]。IL-6由巨噬細(xì)胞和上皮細(xì)胞分泌，參與機(jī)體免疫反應(yīng)、腫瘤進(jìn)展、組織修復(fù)等過程[7]。最近研究發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜異位患者腹腔液和血清中IL-6表達(dá)均明顯升高，且隨著子宮內(nèi)膜異位癥分期增加，患者腹腔液、血清IL-6水平呈明顯上升趨勢；提示IL-6 可能參與子宮內(nèi)膜異位的發(fā)生發(fā)展過程。此外，IL-6可促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖活化，引發(fā)機(jī)體自身免疫炎癥反應(yīng)導(dǎo)致免疫損傷；IL-6還可促進(jìn)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞增殖，最終導(dǎo)致子宮內(nèi)膜異位發(fā)生[7]。然而，IL-6在子宮內(nèi)膜異位中促進(jìn)上皮細(xì)胞增殖、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的潛在機(jī)制仍未完全闡明。

本研究檢測了IL-6在子宮內(nèi)膜異位患者血清中表達(dá)及其對原代培養(yǎng)子宮內(nèi)膜異位癥患者上皮細(xì)胞增殖及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響，同時檢測了其可能作用通路蛋白表達(dá)變化，并用免疫組化在病理樣本中進(jìn)行驗(yàn)證，進(jìn)一步揭示了IL-6促進(jìn)子宮內(nèi)膜異位發(fā)生進(jìn)展的潛在機(jī)制，為臨床診斷治療提供了新思路。

1 資料與方法

1.1資料 收集2014年6月～2017年1月間，鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院腹腔鏡手術(shù)切除的卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫(又稱卵巢巧克力囊腫)臨床樣本共111例，上述子宮內(nèi)膜異位標(biāo)本均經(jīng)過至少2位病理科醫(yī)生診斷，且無其他重大內(nèi)科疾病及接受激素治療，另選取64例生殖中心對不孕患者原發(fā)不孕或內(nèi)膜回聲不均患者行內(nèi)膜搔刮術(shù)獲取的內(nèi)膜組織作為對照?；颊吣挲g在18～45歲間，且本研究已獲得所有患者知情同意及鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會同意，所有實(shí)驗(yàn)操作均按照相關(guān)的指導(dǎo)方針和規(guī)定進(jìn)行。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 將獲取的手術(shù)切除子宮內(nèi)膜組織迅速運(yùn)至無菌操作臺中，用無菌Hank′s緩沖液(HBSS)(Hyclone，美國)洗滌3次，無菌剪刀剪碎并用0.03%的膠原酶Ⅳ(Sigma，美國)于細(xì)胞培養(yǎng)箱中消化40 min。取出用無菌篩網(wǎng)(Thermo Fisher Scientific，美國)過濾懸液，將未被消化完全的組織塊分離出來，將細(xì)胞懸液進(jìn)行離心，重懸進(jìn)行選擇性接觸來純化子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞。將純化的細(xì)胞用含10%胎牛血清(Gibco，美國)、1%青鏈霉素(Gibco，美國)和2 μg/ml氟康唑(BD，美國)的DMEM/F12培養(yǎng)液(Gibco，美國)重懸，并置于37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo Fisher Scientific，美國)中培養(yǎng)，待細(xì)胞達(dá)到80%～90%融合度時進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2細(xì)胞因子IL-6檢測 收集患者空腹靜脈5 ml，3 000 r/min離心10 min取上清，并置于-80℃保存待測。利用雙抗體夾心ELISA法(R&D systems，美國)按照試劑盒操作步驟進(jìn)行檢測，將得到的數(shù)據(jù)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸計(jì)算IL-6血清濃度。

1.2.3細(xì)胞增殖檢測 使用MTT法檢測細(xì)胞增殖能力，取5×103個細(xì)胞接種于96孔板中，待細(xì)胞貼壁后，分別于24、48、72 h將20 μl的5 mg/ml的MTT(Sigma，美國)溶液加到各孔中，將細(xì)胞繼續(xù)于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育4 h，取出棄上清，每孔加入150 μl的DMSO(生工生物，上海)并在全波長酶標(biāo)儀上振蕩10 min，檢測490 nm處各孔吸光度值，參考波長為570 nm。

1.2.4細(xì)胞侵襲遷移實(shí)驗(yàn) 使用Transwell 小室(BD，美國)檢測細(xì)胞侵襲遷移能力變化，預(yù)鋪基質(zhì)膠的Transwell小室用于檢測細(xì)胞侵襲能力變化，使用前用無菌PBS或無血清培養(yǎng)基水化30 min，而無基質(zhì)膠的Transwell小室用于檢測細(xì)胞遷移能力變化。取5×104個細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基中重懸并接種至Transwell的上室中，下室加含10%胎牛血清完全培養(yǎng)基，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育48 h后，棉球擦去上室未穿膜細(xì)胞，用結(jié)晶紫(Solarbio，美國)染穿過膜的細(xì)胞，顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)。

1.2.5Western blot檢測 用添加蛋白酶抑制劑(Roche，美國)和磷酸酶抑制劑(Sigma，美國)的RIPA裂解液(全式金，北京)裂解細(xì)胞，4℃、12 000 r/min離心10 min取上清，BCA法(全式金，北京)測蛋白濃度。用SDS-PAGE電泳分離總蛋白(20 μg)并轉(zhuǎn)移到聚偏二氯乙烯膜(Millipore，德國)上，用0.5%的脫脂牛奶封閉膜，并用p-STAT3、STAT3、BCL6和β-actin(CST，美國)一抗孵育，用過ECL發(fā)光液(Millipore，德國)進(jìn)行顯影，并用Image J軟件測定條帶強(qiáng)度，β-actin做內(nèi)參進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.2.6免疫組化 按照先前文獻(xiàn)所述進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析[8]。用含10%血清的PBS封閉子宮內(nèi)膜組織石蠟切片，并用抗BCL6(CST，美國)進(jìn)行孵育，然后將切片與偶聯(lián)辣根過氧化物酶的二抗(福州邁新)一起溫育，用DAB試劑盒(福州邁新)檢測免疫反應(yīng)性并用蘇木精復(fù)染，顯微鏡觀察并用半定量分級系統(tǒng)(H-score)比較免疫組化染色強(qiáng)度。

2 結(jié)果

2.1IL-6在子宮內(nèi)膜異位患者血清中的表達(dá) 子宮內(nèi)膜異位癥是一種慢性炎癥疾病，為了更好地了解子宮內(nèi)膜異位癥患者的炎癥狀態(tài)，我們使用ELISA測量了患有和不患有子宮內(nèi)膜異位癥的婦女血清中IL-6炎性細(xì)胞因子表達(dá)，研究結(jié)果顯示，與不患有子宮內(nèi)膜異位癥的對照組相比，子宮內(nèi)膜異位癥患者血清IL-6水平明顯升高(0.97±1.07、2.29±1.47，t=6.285,P<0.01)(圖1)。

2.2IL-6 對子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞增殖影響 通過原代培養(yǎng)的子宮內(nèi)膜異位癥腺上皮細(xì)胞成團(tuán)生長，呈上皮樣。用不同濃度的IL-6(0、5、10、20、40 ng/ml)處理細(xì)胞，MTT檢測其對細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與IL-6(0 ng/ml)組相比，IL-6 可呈濃度依賴性地促進(jìn)細(xì)胞增殖(0.24±0.02、0.36±0.01、0.53±0.04、0.70±0.04、0.72±0.04，F(xiàn)=124.528，P=0.000)，而20 ng/ml組與40 ng/ml組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖2)，故后續(xù)研究選擇 20 ng/ml 濃度IL-6進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。

2.3IL-6誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化子宮內(nèi)膜異位癥通常在卵巢和腹膜上發(fā)現(xiàn)子宮外腺體和間質(zhì)的存在，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化在這一過程中扮演者重要角色，利用Western blot檢測上皮間質(zhì)標(biāo)記物，發(fā)現(xiàn)與0 ng/ml組相比，20 ng/ml的IL-6處理細(xì)胞后，其上皮標(biāo)記物E-cadherin表達(dá)明顯降低(t1=7.405，P1<0.01)，間質(zhì)標(biāo)記物vimentin和Snail表達(dá)顯著增加(t2=9.032，P2<0.01；t3=9.279，P3<0.01)(圖3、表1)。

圖1 IL-6在子宮內(nèi)膜異位患者血清中的表達(dá)Fig.1 Expression of IL-6 in serum of patients with endometriosisNote: *.P<0.01 compared with Control group.

圖2 IL-6對子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞增殖的影響Fig.2 Effect of IL-6 on proliferation of endometrial epithelial cellsNote: *.P<0.05 compared with IL-6 (0 ng/ml) group；#.P<0.05 compared with IL-6 (5 ng/ml) group.Compared with the IL-6 (10 ng/ml) group,△.P<0.05.

由此可知，IL-6可誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。

2.4IL-6 對子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞侵襲遷移的影響 IL-6可誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，故利用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測其對細(xì)胞侵襲遷移能力的影響，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)與0 ng/ml組相比，20 ng/ml的IL-6處理后，細(xì)胞侵襲能力和遷移能力均顯著降低(99.6±13.7、154.3±18.6，t1=4.101，P1<0.05；102.4±12.3、196.5±18.2，t2=7.420，P2<0.01)(圖4)。由此可知，IL-6可增強(qiáng)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞侵襲遷移能力。

2.5IL-6 對子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞STAT3/BCL6通路影響 有研究發(fā)現(xiàn)，BCL6可被IL-6等炎癥因子及STAT3刺激上調(diào)[9]，故利用Western blot檢測IL-6處理子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞后BCL6、 STAT3、 p-STAT3蛋白表達(dá)。

圖3 IL-6處理后上皮間質(zhì)標(biāo)記物的表達(dá)Fig.3 Expression of epithelial mesenchymal markers after IL-6 treatment

GroupsProtein levelsE-cadherinvimentinSnail0 ng/ml0.953±0.0810.324±0.0210.168±0.00920 ng/ml0.532±0.0561)1.021±0.1321)0.456±0.0531)

Note:1)P<0.01 vs 0 ng/ml group.

圖4 IL-6對細(xì)胞侵襲遷移能力影響Fig.4 Effect of IL-6 on cell invasion and migrationNote: *.P<0.05 compared to 0 ng/ml group.

圖5 IL-6處理細(xì)胞后STAT3/BCL6通路蛋白表達(dá)Fig.5 Expression of STAT3/BCL6 pathway proteins after IL-6 treatment

Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，與0 ng/ml組相比，20 ng/ml和40 ng/ml的IL-6處理細(xì)胞后，細(xì)胞中p-STAT3、BCL6表達(dá)均顯著增加，STAT3表達(dá)無明顯變化；與20 ng/ml組相比，40 ng/ml的IL-6處理細(xì)胞后細(xì)胞中p-STAT3、BCL6、STAT3表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖5，表2)。由此可知，IL-6可誘導(dǎo)細(xì)胞中STAT3通路激活上調(diào)BCL6表達(dá)。

2.6BCL6在子宮內(nèi)膜異位組織中的表達(dá) 為進(jìn)一步驗(yàn)證IL-6可誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中STAT3/BCL6通路激活，我們利用免疫組化法檢測了BCL6在子宮內(nèi)膜異位組織中的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與Control組相比，子宮內(nèi)膜異位組織中BCL6顯著高表達(dá)(32.12±22.25、167.27±90.04，t=15.352，P<0.01)。由此推測，在子宮內(nèi)膜異位患者中IL-6高表達(dá)可能通過誘導(dǎo)BCL6表達(dá)促進(jìn)疾病進(jìn)展，見圖6。

3 討論

子宮內(nèi)膜異位癥主要指子宮內(nèi)膜腺體及間質(zhì)組織異位至子宮內(nèi)膜外引發(fā)的育齡期婦女常見婦科疾病，通常以異位至宮骶韌帶、卵巢部位為主[10,11]。臨床癥狀常常表現(xiàn)為盆腔疼痛、黏連、不孕，異位組織細(xì)胞與惡性癌細(xì)胞一樣，具有惡性增殖、侵襲轉(zhuǎn)移特性[12]。

GroupsRelative levels of proteinp-STAT3STAT3BCL60 ng/ml group0.301±0.0211.356±0.1210.065±0.0085 ng/ml group0.306±0.0241.321±0.1320.264±0.02110 ng/ml group0.291±0.0191.345±0.1060.879±0.09420 ng/ml group1.231±0.1351)1.301±0.1161.297±0.1351)40 ng/ml group1.138±0.1071)1.312±0.1241.246±0.1181)F114.0830.109114.542P0.0000.9770.000

Note:1)P<0.01 compared to the 0 ng/ml group.

圖6 BCL6在子宮內(nèi)膜異位患者組織中的表達(dá)Fig.6 Expression of BCL6 in endometriotic tissueNote: *.P<0.01 compared with Control group.

迄今為止，對于子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生進(jìn)展機(jī)制尚未明確，異位種植學(xué)說是目前公認(rèn)的理論機(jī)制，而近年來大量臨床研究表明，多種免疫炎癥反應(yīng)有關(guān)的細(xì)胞因子、炎癥因子參與了子宮內(nèi)膜異位病灶形成，但其中潛在作用機(jī)制仍未闡明[13,14]。

IL-6是一種由單核巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞、滋養(yǎng)層細(xì)胞等分泌的細(xì)胞因子，參與機(jī)體的免疫炎癥反應(yīng)和組織修復(fù)過程，研究表明其高表達(dá)與盆腔局部黏連及輸卵管損傷有關(guān)[15,16]。此外，IL-6還參與炎癥瘢痕形成，刺激輸卵管成纖維細(xì)胞增生進(jìn)而導(dǎo)致輸卵管阻塞引起不孕癥發(fā)生[13]。許多研究表明，與無子宮內(nèi)膜異位癥相比，子宮內(nèi)膜異位患者血清中IL-6明顯增高，但其作用機(jī)制仍不清楚。有研究認(rèn)為IL-6可刺激P450芳香酶表達(dá)，導(dǎo)致異位內(nèi)膜發(fā)生種植，其在卵泡中的表達(dá)也會相應(yīng)增高，引起卵泡發(fā)育不良，從而導(dǎo)致不孕癥[13,17]。在本研究中發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜異位患者血清中IL-6表達(dá)顯著增加，且利用不同濃度IL-6處理原代子宮內(nèi)膜異位上皮細(xì)胞可呈濃度依賴促進(jìn)細(xì)胞增殖，其中20 ng/ml 最明顯，同時也可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，促進(jìn)細(xì)胞侵襲遷移。

BCL6是轉(zhuǎn)錄抑制因子，是B細(xì)胞發(fā)育和腫瘤發(fā)生所必需的[18]。BCL6由6個Krüppel型鋅結(jié)構(gòu)域和一個能夠結(jié)合包括干擾素調(diào)節(jié)因子(IRF)4和BCL6相關(guān)鋅指蛋白(BAZF)在內(nèi)的BTB/POZ結(jié)構(gòu)域組成；BCL6是人類原癌基因之一，且可通過抑制諸如p53和p30019基因表達(dá)來促進(jìn)細(xì)胞增殖；BCL6的DNA結(jié)合位點(diǎn)[TTCCT(A/C)GAA]與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT)類似，BCL6可通過STAT因子結(jié)合位點(diǎn)抑制轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而抑制細(xì)胞因子誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄[3]。此外，BCL6可被STAT3誘導(dǎo)上調(diào)[19]。與無子宮內(nèi)膜異位患者相比，子宮內(nèi)膜異位癥患者的異位子宮內(nèi)膜中STAT3信號異常激活[8]。最近有研究報(bào)道，BCL6在子宮內(nèi)膜異位癥患者的月經(jīng)周期分泌期異位組織中高表達(dá)[20]。故我們猜想IL-6可能通過激活STAT3/BCL6通路發(fā)揮功能。通過Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，隨著IL-6濃度增加，細(xì)胞中p-STAT3、BCL6表達(dá)逐漸升高，同時我們利用免疫組化發(fā)現(xiàn)BCL6在子宮內(nèi)膜異位癥標(biāo)本中高表達(dá)，提示IL-6可激活STAT3/BCL6信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在子宮內(nèi)膜異位中發(fā)揮作用。

綜上所述，本研究證實(shí)了IL-6、BCL6在子宮內(nèi)膜異位患者血清和組織標(biāo)本中高表達(dá)，且隨著IL-6濃度增加可呈劑量依賴地促進(jìn)子宮內(nèi)膜異位上皮細(xì)胞中STAT3/BCL6通路激活，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，進(jìn)一步揭示了IL-6促進(jìn)子宮內(nèi)膜異位發(fā)生進(jìn)展的潛在機(jī)制，為臨床診斷治療提供了新思路。