郭東明 張 奇 何東升 江躍全 王志強(qiáng)

(重慶大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院/重慶市腫瘤研究所/重慶市腫瘤醫(yī)院，腫瘤轉(zhuǎn)移與個(gè)體化診治轉(zhuǎn)化研究重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,重慶400030)

肺癌是全球最為嚴(yán)重的惡性腫瘤，發(fā)病率和死亡率都居癌癥之首。2012年全世界肺癌新增病例180萬，占所有癌癥新增病例的12.9%；肺癌死亡病例160萬，占所有癌癥死亡病例的19.4%[1]。肺癌包括兩種組學(xué)亞型：小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌，其中大部分為非小細(xì)胞肺癌，約占85%[2]。肺癌的治療是人類醫(yī)療衛(wèi)生系統(tǒng)的重大課題。MicroRNAs (miRs)是一種長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的小型單鏈非編碼RNA分子，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)。各種癌癥中出現(xiàn)了許多異常表達(dá)的microRNAs，這些異常表達(dá)的microRNAs在致癌和癌癥進(jìn)展中起著重要作用[3]。大量研究表明在非小細(xì)胞肺癌的治療中microRNAs已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)[4,5]。miR-34家族包括miR-34a/b/c三個(gè)成員。miR-34b在乳腺癌、骨肉瘤及前列腺癌等癌癥進(jìn)程中發(fā)揮著重要作用[6-8]。據(jù)報(bào)道m(xù)iR-34b在非小細(xì)胞肺癌組織中低表達(dá)，miR-34b表達(dá)水平與非小細(xì)胞肺癌患者腫瘤的轉(zhuǎn)移性存在密切聯(lián)系[9-11]。但關(guān)于miR-34b對(duì)非小細(xì)胞肺癌侵襲和遷移的調(diào)控作用的報(bào)道還十分罕見，miR-34b在肺癌中的具體作用還有待進(jìn)一步研究。本文的主要目的是探究miR-34b對(duì)非小細(xì)胞肺癌A549侵襲和遷移的影響。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞系與主要試劑 非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549來源于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心 (American Type Culture Collection,ATCC)。RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清和轉(zhuǎn)染試劑TurboFect Transfection Regent購自賽默飛世爾科技公司。miR-34b mimic和pc-HIF1α過表達(dá)載體由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成提供。RNA提取試劑盒和定量PCR試劑盒SYBR Premix Ex TaqTM購自大連TaKaRa公司。熒光素酶檢測(cè)試劑盒來源于Promega公司。Transwell小室及人工基底膜購自美國(guó)BD公司?？谷毖跽T導(dǎo)因子-1α(Hypoxia inducible factor-1α,HIF1α)抗體，抗基質(zhì)金屬蛋白酶2(Matrix metalloprotein 2,MMP-2)抗體，抗Snail抗體和抗血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)抗體購自Abcam公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 A549細(xì)胞于含10%胎牛血清和1%青-鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基，并置于37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞增殖到70%～80%時(shí)進(jìn)行傳代。將A549細(xì)胞分為4組：A549 (空對(duì)照)組，miR-34b mimic組，pc-HIF1α組和miR-34b mimic+pc-HIF1α組。按照轉(zhuǎn)染試劑TurboFect Transfection Regent的說明書向A549細(xì)胞單獨(dú)或同時(shí)轉(zhuǎn)染miR-34b mimic和pc-HIF1α過表達(dá)載體。

1.2.2實(shí)時(shí)定量PCR (Quantitative real-time reverse transcription PCR,qRT-PCR) 首先用RNA提取試劑盒提取總RNA后再反轉(zhuǎn)成cDNA，然后用下列引物進(jìn)行PCR，miR-34b上游引物：5′-TGCGTGTCGT-GGAGTC-3′，miR-34b下游引物：5′-GCGAATCACTAACTCCACT-3′。HIF1α上游引物：5′-TTGCTCAT-CAGTTGCCACTTCC-3′，HIF1α下游引物：5′-AGCAATTCATCTGTGCTTTCATGTC-3′。根據(jù)SYBR Premix Ex TaqTM說明書進(jìn)行qRT-PCR，用公式2-ΔΔCt計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3熒光素酶實(shí)驗(yàn) 用洗滌液對(duì)待測(cè)細(xì)胞進(jìn)行洗滌，棄去洗滌液后在孔中加入1×細(xì)胞裂解液將細(xì)胞裂解。然后室溫下于振蕩器上振蕩5～10 min，移入離心管中離心，3 000 r/min，5 min，離心后取上清進(jìn)行發(fā)光測(cè)定。按照試劑盒說明書和儀器操作說明對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行發(fā)光值測(cè)定。

1.2.4蛋白印跡 首先用PBS清洗待測(cè)細(xì)胞3次后加入含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液提取總蛋白，100℃變性5 min。然后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分離并轉(zhuǎn)至PVDF膜。經(jīng)5%的BSA封閉1 h后加入相應(yīng)的一抗，4℃過夜孵育，第二天加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1.5 h。最后加入發(fā)光液后于凝膠成像儀進(jìn)行曝光拍照并統(tǒng)計(jì)灰度值計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5Transwell檢測(cè)細(xì)胞侵襲 待測(cè)細(xì)胞用無血清的培養(yǎng)基制成1×106個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，再將上述細(xì)胞懸液加入鋪有人工基底膜的Transwell的上室中，同時(shí)在下室中加入含20%胎牛血清的培養(yǎng)基。37℃培養(yǎng)24 h后，用吉姆薩染色液對(duì)上室底部細(xì)胞進(jìn)行染色，同時(shí)用棉簽除去上室內(nèi)側(cè)的細(xì)胞。顯微鏡下觀察并統(tǒng)計(jì)細(xì)胞數(shù)量。

1.2.6劃痕檢測(cè)細(xì)胞遷移 首先將待測(cè)細(xì)胞制成1×106個(gè)/ml的細(xì)胞懸液后加入6孔板中，過夜培養(yǎng)至形成單層細(xì)胞。在單層細(xì)胞上用10 μl的槍頭劃?rùn)M線，PBS洗3次以洗去因劃痕而脫落的細(xì)胞。顯微鏡下拍照測(cè)量劃痕寬度，培養(yǎng)24 h后再取出拍照測(cè)量劃痕寬度。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩兩比較用獨(dú)立的t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1轉(zhuǎn)染miR-34b mimic對(duì)肺癌A549細(xì)胞miR-34b表達(dá)的影響 向肺癌A549細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-34b mimic后，利用qRT-PCR檢測(cè)miR-34b表達(dá)。如圖1所示，mimic-scramble組miR-34b表達(dá)與對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。miR-34b mimic組miR-34b表達(dá)顯著高于對(duì)照組(P<0.001)。由此可見，轉(zhuǎn)染miR-34b mimic可提高肺癌A549細(xì)胞miR-34b表達(dá)。

2.2轉(zhuǎn)染miR-34b mimic可降低肺癌A549細(xì)胞HIF1α的mRNA水平 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-34b與HIF1α存在靶向關(guān)系后，通過qRT-PCR檢測(cè)HIF1α的mRNA水平。由圖2可知，在A549細(xì)胞中轉(zhuǎn)染mimic-scramble不會(huì)影響HIF1α的mRNA水平。轉(zhuǎn)染miR-34b mimic后，A549細(xì)胞HIF1α的mRNA水平顯著下降(P<0.001)。上述結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染miR-34b mimic可降低肺癌A549細(xì)胞HIF1α的mRNA水平。

2.3miR-34b直接靶向HIF1α 利用熒光素酶進(jìn)一步驗(yàn)證miR-34b與HIFα的靶向關(guān)系。

圖1 qRT-PCR檢測(cè)miR-34b表達(dá)Fig.1 Expression of miR-34b was detected by qRT-PCRNote: ***.P<0.001 vs.A549 group.

圖2 qRT-PCR檢測(cè)HIF1α的mRNA水平Fig.2 mRNA levels of HIF1α were measured by qRT-PCRNote: ***.P<0.001 vs.A549 group.

圖3顯示，在HIF1α野生型細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-34b mimic后，熒光素酶活性顯著減弱(P<0.01)。但向HIF1α突變型細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-34b mimic則不會(huì)影響熒光素酶的活性。以上結(jié)果說明，miR-34b可直接靶向HIF1α。

2.4miR-34b負(fù)向調(diào)控HIF1α表達(dá) 通過蛋白印跡檢測(cè)HIF1α的蛋白水平，分析單獨(dú)或同時(shí)轉(zhuǎn)染miR-34b mimic和pc-HIF1α對(duì)肺癌A549細(xì)胞HIF1α蛋白水平的影響。

圖3 熒光素酶驗(yàn)證miR-34b與HIF1α的靶向關(guān)系Fig.3 Targeted relationship of miR-34b and HIF1α was verified by luciferase assasyNote: **.P<0.01 VS.HIF1α wild type cells.

圖4 蛋白印跡檢測(cè)HIF1α的蛋白水平Fig.4 Protein levels of HIF1α were tested by Western blotNote: **.P<0.01 vs.A549 group；##.P<0.01 vs.pc-HIF1α group.

圖5Transwell檢測(cè)細(xì)胞侵襲

Fig.5CellinvasionwasdetectedbyTranswell

Note: **.P<0.01 vs.A549 group；##.P<0.01 vs.pc-HIF1α group.

圖6 劃痕實(shí)驗(yàn)分析細(xì)胞遷移Fig.6 Cell migration was tested by wound healingNote: **.P<0.01 vs.A549 group；##.P<0.01 vs.pc-HIF1α group.

如圖4所示，miR-34bmimic組HIF1α蛋白水平顯著低于對(duì)照組(P<0.01)。pc-HIF1α組HIF1α蛋白水平顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。與pc-HIF1α組相比，miR-34b mimic+pc-HIF1α組HIF1α蛋白水平顯著下降(P<0.01)。由此可見，miR-34b負(fù)向調(diào)控肺癌A549細(xì)胞HIF1α表達(dá)。

2.5miR-34b靶向HIF1α減弱細(xì)胞侵襲 為分析miR-34b對(duì)肺癌A549細(xì)胞侵襲的影響，Tanswell檢測(cè)各組細(xì)胞侵襲。由圖5可知，miR-34b mimic組每個(gè)視野下的侵襲細(xì)胞數(shù)目顯著少于對(duì)照組(P<0.01)。pc-HIF1α組每個(gè)視野下的侵襲細(xì)胞數(shù)目顯著多于對(duì)照組(P<0.01)。與pc-HIF1α組相比，miR-34b mimic+pc-HIF1α組每個(gè)視野下的侵襲細(xì)胞數(shù)目顯著變少(P<0.01)。上述結(jié)果表明，miR-34b可通過靶向HIF1α減弱肺癌A549細(xì)胞侵襲。

2.6miR-34b靶向HIF1α抑制細(xì)胞遷移 利用劃痕實(shí)驗(yàn)分析miR-34b對(duì)肺癌A549細(xì)胞遷移的影響。圖6顯示，miR-34b mimic組劃痕愈合率顯著低于對(duì)照組(P<0.01)。pc-HIF1α組劃痕愈合率顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。與pc-HIF1α組相比，miR-34b mimic+pc-HIF1α組劃痕愈合率顯著降低(P<0.01)。以上結(jié)果說明，miR-34b可通過靶向HIF1α抑制肺癌A549細(xì)胞遷移。

圖7 蛋白印跡檢測(cè)侵襲和遷移相關(guān)蛋白的表達(dá)Fig.7 Expression of invasion and migration related proteins was measured by Western blotNote: **.P<0.01 vs.A549 group；##.P<0.01 vs.pc-HIF1α group.

2.7miR-34b靶向HIF1α對(duì)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 通過蛋白印跡檢測(cè)MMP-2、Snail和VEGF的表達(dá)，分析miR-34b對(duì)肺癌A549細(xì)胞運(yùn)動(dòng)相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。如圖7所示，miR-34b mimic組MMP-2、Snail和VEGF相對(duì)蛋白水平低于對(duì)照組(P<0.01)。pc-HIF1α組MMP-2、Snail和VEGF相對(duì)蛋白水平高于對(duì)照組(P<0.01)。與pc-HIF1α組相比，miR-34b mimic+pc-HIF1α組MMP-2、Snail和VEGF相對(duì)蛋白水平下降(P<0.01)。由此可見，miR-34b可通過靶向HIF1α抑制A549細(xì)胞運(yùn)動(dòng)相關(guān)蛋白MMP-2、Snail和VEGF的表達(dá)。

3 討論

肺癌是中國(guó)發(fā)病率和死亡率最高的癌癥，中國(guó)的肺癌形勢(shì)十分嚴(yán)峻，2012年中國(guó)新增肺癌病例70.48萬，占全世界肺癌病例的39.2%；肺癌死亡病例56.94萬，占全世界肺癌死亡病例的35.6%[12]。而且，中國(guó)的肺癌負(fù)擔(dān)還在不斷增加，2015年中國(guó)新增肺癌病例達(dá)73.33萬，肺癌死亡病例達(dá)61.02萬[13]。目前治療肺癌最為普遍的方法包括外科手術(shù)、放療、化療，但這些方法僅對(duì)局部癌癥的患者能起到較好的效果，而對(duì)已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移的晚期癌癥患者的治療效果并不理想[14,15]。開發(fā)更加有效的治療方法迫在眉睫。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，靶向治療受到了越來越多的關(guān)注。大量研究表明microRNAs在癌癥的靶向治療中具有很大的潛能[16]。

細(xì)胞的侵襲能力在癌癥的轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要作用。許多microRNAs具有調(diào)控癌細(xì)胞侵襲的功能。有數(shù)據(jù)顯示在A549細(xì)胞中miR-137過表達(dá)可負(fù)向調(diào)控PXN表達(dá)，降低細(xì)胞侵襲[17]。有研究發(fā)現(xiàn)miR-675-5p可通過抑制GPR55表達(dá)減弱A549細(xì)胞侵襲[18]。據(jù)報(bào)道m(xù)iR-34a可通過負(fù)向調(diào)控神經(jīng)母細(xì)胞瘤CD44表達(dá)抑制細(xì)胞侵襲[19]。有數(shù)據(jù)顯示miR-34a和miR-34c可直接靶向Fra-1減弱乳腺癌細(xì)胞侵襲[20]。另外，在膀胱癌細(xì)胞中miR-34a可直接靶向HNF4G抑制細(xì)胞侵襲[21]。Garofalo等[22]發(fā)現(xiàn)在非小細(xì)胞肺癌H1703和Calu-6細(xì)胞中，miR-34a和miR-34c可通過降低PDGFR-α/β表達(dá)抑制細(xì)胞侵襲。本研究結(jié)果顯示，在非小細(xì)胞肺癌A549中，miR-34b負(fù)向調(diào)控HIF1α表達(dá)，miR-34b可直接靶向HIF1α減弱細(xì)胞侵襲。

越來越多的研究表明microRNAs在癌細(xì)胞遷移方面也發(fā)揮著重要作用。據(jù)報(bào)道在非小細(xì)胞肺癌A549和H157細(xì)胞中，miR-153可通過靶向ADAM19減弱細(xì)胞遷移[23]。Wang等[24]發(fā)現(xiàn)在胃癌細(xì)胞中，miR-34a/b/c可通過靶向YY1降低細(xì)胞遷移。在食管鱗狀細(xì)胞癌中，miR-34a可通過靶向MMP-2/MMP-9/ FNDC3B抑制細(xì)胞遷移[25]。另外，miR-34a還可通過負(fù)向調(diào)控AXL減弱卵巢癌細(xì)胞遷移[26]。有研究表明miR-34c-3p過表達(dá)可通過抑制eIF4E表達(dá)降低A549細(xì)胞侵遷移能力[27]。本文結(jié)果顯示，miR-34b可通過靶向HIF1α抑制肺癌A549細(xì)胞遷移。

本研究表明，在非小細(xì)胞肺癌A549中，miR-34b負(fù)向調(diào)控HIF1α表達(dá)，miR-34b可直接靶向HIF1α減弱細(xì)胞侵襲和遷移，抑制運(yùn)動(dòng)相關(guān)蛋白MMP-2、Snail和VEGF的表達(dá)。后續(xù)研究將通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)探索miR-34b在肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用。