劉 萍 韓達斌 馬金華 劉 慧 雷 嬌

(青海大學附屬醫(yī)院藥劑科，西寧810001)

肺癌是迄今為止世界上最常見的惡性腫瘤。全世界每年有近百萬人死于肺癌，中國近60萬人死于肺癌及其并發(fā)癥[1,2]。雖然目前在臨床和腫瘤實驗方面取得了很多進展，但肺癌的診斷和治療仍不盡如人意，5年總生存率僅為11%[3,4]。其中非小細胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)在肺癌中的發(fā)病率最高，約占肺腫瘤的85%[5]。由于腫瘤細胞在體內(nèi)增殖和轉(zhuǎn)移的具體機制相對復(fù)雜，臨床上對出現(xiàn)轉(zhuǎn)移的非小細胞肺癌的診斷時機受到一定的限制[6]。一般而言，化療聯(lián)合手術(shù)切除是非小細胞肺癌的經(jīng)典治療策略[7]。然而，化療總是伴有一些嚴重的副作用，如白細胞減少、肝功能不全和腎功能紊亂[8]。因此，需要更安全的治療策略和更徹底的研究來改善非小細胞肺癌的治療現(xiàn)狀。

蘆薈苷也被命名為蘆薈酵素(C21H22O9)，是一種天然的生物活性蒽環(huán)類抗生素。通常從蘆薈葉中提取純凈的蘆薈苷[9]。相關(guān)報告顯示蘆薈苷具有抗炎、抗菌、抗氧化活性，抗病毒和抗癌潛力[10]。此外，之前的研究發(fā)現(xiàn)了蘆薈苷在調(diào)節(jié)人類惡性腫瘤(如結(jié)腸癌、乳腺癌、卵巢癌、子宮癌等)細胞周期阻滯和凋亡中的有效作用。已經(jīng)證明蘆薈苷能夠抑制乳腺癌MDA-MB-231細胞和人卵巢癌細胞系HO-8910PM的侵襲和轉(zhuǎn)移行為[11,12]。上述研究說明了蘆薈苷在抑制惡性腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移中的潛力。此外，其他研究人員提出，蘆薈苷通過p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)-NF-κB依賴性途徑下調(diào)MMP-2的表達，從而抑制鼻咽癌細胞的侵襲[13]。從而確定p38是蘆薈苷誘導(dǎo)NSCLC H460細胞凋亡的重要決定因素。然而，沒有具體研究顯示非甾體抗炎藥物中蘆薈苷的抗癌潛力。

1 材料與方法

1.1細胞株及實驗材料 蘆薈苷和3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四唑溴化物(MTT)購自美國Sigma公司；p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR和GAPDH購自美國圣克魯斯生物技術(shù)公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 人非小細胞肺癌細胞獲自武漢大學細胞培養(yǎng)物中心。細胞生長培養(yǎng)條件：10%FBS，50 μg/ml鏈霉素和50 μg/ml青霉素的培養(yǎng)基(MEM)，37℃，5%CO2進行孵育。

1.2.2定量實時聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR) qPCR使用TRIzol試劑盒從非小細胞肺癌患者和對照組織中提取總RNA。 用TaqMan MicroRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄以合成cDNA有義鏈。然后在Real-time PCR系統(tǒng)中進行qPCR反應(yīng)。 U6被視為內(nèi)部控制參數(shù)。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min、95℃變性15 s、60℃退火32 s，循環(huán)50次后檢測其溶解曲線，檢測完成后，通過計算機系統(tǒng)自動分析各樣本Ct值，然后采用2-ΔΔCt計算miRNA的相對表達量。實驗重復(fù)3次。

1.2.3測定細胞活力 細胞活力評估使用MTT細胞活性實驗測定。用蘆薈苷處理非小細胞肺癌細胞24 h后，去除培養(yǎng)基。使用MTT試劑在10%乙醇和0.1%試劑染液中對其進行處理，在室溫下持續(xù)5 min，然后充分漂洗3次。使用95%乙醇提取，使用ELISA讀數(shù)器測定吸光度。在相差顯微鏡下觀察細胞，并使用DCM300數(shù)碼相機拍照顯微鏡，計數(shù)并統(tǒng)計細胞活力數(shù)據(jù)。

1.2.4流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 流式細胞術(shù)FITC-Annexin V/PI雙染色被認為是理想的定量測定細胞凋亡的方法。將HCT116細胞以2×106細胞/孔的密度接種在6孔板中，生長24 h。使用蘆薈苷處理細胞24 h后，加入100 μl細胞懸液5 μl Annexin V-FITC和10 μl PI，并將細胞在黑暗中孵育30 min。 PI(5 μl，濃度為10 μg/ml)加入細胞，在黑暗中再次孵育10 min。通過流式細胞術(shù)評估細胞以識別細胞周期的變化。細胞凋亡指數(shù)按照下列公式計算：PI%=(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)。

1.2.5細胞周期分析 細胞使用胰蛋白酶消化，調(diào)整至5×105～1×106個細胞/管，使用冰冷的磷酸鹽緩沖液沖洗后，重懸在2 ml的乙醇中。在4℃孵育1 h后，除去乙醇將100 μl核糖核酸酶溶液(10 mg/ml)加入到每個試管中。然后將試管在室溫下再培養(yǎng)30 min，并加入500 μl的分析溶液(PBS中的37 mmol/L EDTA和0.1%Triton X-100)，然后加入100 μl碘化丙錠溶液(400 μg/ml)。樣品在4℃黑暗中保存，并使用流式細胞儀進行分析。

1.2.6Western blot 肺癌細胞在60 mm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，使用無血清培養(yǎng)基饑餓24 h，在指定的時間點用熊果苷處理。將樣品在12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠上分離并轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，用5%的Tween20的PBS中加入脫脂奶粉，孵育20 min，稀釋度為1∶1 000的一抗孵育過夜，p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR、p-H2AX、H2AX和GAPDH，然后與IRDye-結(jié)合的二抗在37℃溫育1 h，室溫下充分沖洗后，使用蛋白二抗孵育加強與一抗的蛋白反應(yīng)。蛋白印跡的圖像使用LAS-1000Lumino-圖像分析儀。

2 結(jié)果

2.1蘆薈苷的化學結(jié)構(gòu)及濃度選擇 蘆薈苷可以抑制非小細胞肺癌細胞的生長。為了探討蘆薈苷對非小細胞肺癌細胞活性的影響，用不同濃度(0、10、50和100 μmol/L)的蘆薈苷處理非小細胞肺癌A549細胞。圖1顯示了蘆薈苷的結(jié)構(gòu)。圖2結(jié)果顯示，即使在低濃度(10 μmol/L)時也測量到蘆薈苷對A549細胞的抗增殖作用(P<0.05)，而較高濃度(50和100 μmol/L)的蘆薈苷更明顯降低了A549細胞的增殖水平(P<0.001)。結(jié)果顯示，蘆薈苷在較高濃度時可有效抑制非小細胞肺癌的細胞活力。

2.2蘆薈苷對非小細胞肺癌細胞凋亡行為的影響 為了進一步研究蘆薈苷對非小細胞肺癌細胞活性的影響，通過流式細胞術(shù)探討蘆薈苷誘導(dǎo)A549細胞凋亡和G2/M期細胞周期停滯。流式細胞術(shù)分析表明，用10 μmol/L蘆薈苷處理的A549細胞中沒有檢測到顯著的細胞凋亡差異，而50和100 μmol/L蘆薈苷明顯誘導(dǎo)細胞凋亡(P<0.01，圖3)。

2.3蘆薈苷對非小細胞肺癌細胞周期的影響 細胞周期分析表明，10 μmol/L蘆薈苷引起G2/M期的積累(P<0.05)，50和100 μmol/L蘆薈苷可以明顯誘導(dǎo)G2/M期阻滯，G1期細胞比例相對下降，G2期細胞數(shù)目比例相對上升(P<0.01，圖4)。表明隨著蘆薈苷藥物濃度升高誘導(dǎo)的周期停滯相應(yīng)明顯(圖4)。上述結(jié)果表明，蘆薈苷可以在一定程度上誘導(dǎo)非小細胞肺癌細胞凋亡和細胞停滯行為。

2.4蘆薈苷抑制非小細胞肺癌細胞的侵襲和遷移前者的結(jié)果揭示了蘆薈苷的抗活性作用，然后通過Transwell測定和劃痕試驗來研究蘆薈苷對非小細胞肺癌細胞(A549)的細胞運動的影響。

圖1 蘆薈苷的生物分子結(jié)構(gòu)Fig.1 Biological molecular structure of aloin glycosides

圖2 不同濃度的蘆薈苷對非小細胞肺癌細胞活性的影響Fig.2 Effect of different concentrations of aloin on activity of non-small cell lung cancer cellsNote: *.P<0.05；**.P<0.001.

在A549細胞中，與加入10 μmol/L的蘆薈苷相比，加入蘆薈苷(50和100 μmol/L)的侵襲性細胞的數(shù)量減少了2倍以上(P<0.001，圖5)。 劃痕愈合實驗測定的結(jié)果趨勢與Transwell測定一致。 10 μmol/L蘆薈苷組表現(xiàn)出遷移能力增強，而蘆薈苷(50和100 μmol/L)使間隙增大約30%(P<0.01，圖6)。上述結(jié)果提示蘆薈苷對非小細胞肺癌細胞運動有明顯的抑制作用。

圖3 流式細胞術(shù)檢測蘆薈苷對非小細胞肺癌細胞凋亡行為的影響Fig.3 Flow cytometry assay of effect of aloin on apoptosis in non-small cell lung cancer cells

圖4 蘆薈苷對非小細胞肺癌細胞周期的影響Fig.4 Effect of aloin on cell cycle of non-small cell lung cancer

圖5 蘆薈苷對非小細胞肺癌細胞侵襲能力的影響Fig.5 Effect of aloin on invasion of non-small cell lung cancer cellsNote: *.P<0.05；**.P<0.001.

圖6 蘆薈苷對非小細胞肺癌細胞侵襲能力的影響Fig.6 Effect of aloin glycosides on invasiveness of non-small cell lung cancer cellsNote: *.P<0.05；**.P<0.001.

2.5蘆薈苷抑制裸鼠非小細胞肺癌細胞的生長 實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，蘆薈苷可有效抑制腫瘤形成和腫瘤體積(圖7A)。細胞增殖標志物(Ki-67和PCNA)的水平也在蘆薈苷處理的小鼠組織中明顯降低(圖7B)。上述結(jié)果表明，蘆薈苷可以在體內(nèi)抑制非小細胞肺癌的腫瘤生長。

圖7 蘆薈苷抑制裸鼠非小細胞肺癌細胞的生長Fig.7 Aloin inhibits growth of non-small cell lung cancer cells in nude miceNote: A.The effect of aloin on the tumorigenicity of non-small cell lung cancer in nude mice;B.Expression levels of related proliferating proteins in tumor of nude mice.*.P<0.05.

3 討論

肺癌是世界范圍內(nèi)惡性程度較高的腫瘤類型之一。在中國，45歲以下的肺癌患者的比率相對較高，非小細胞肺癌是最常見的肺癌類型[14]。目前，化療聯(lián)合手術(shù)切除是NSCLC治療中最常用的方法。然而，肺癌的治療仍不能令人滿意，副作用和復(fù)發(fā)多。因此深入了解非小細胞肺癌發(fā)生、發(fā)展的分子機制，開發(fā)新的治療方法至關(guān)重要[15]。近年來，天然草藥產(chǎn)品由于其抗腫瘤活性，包括凋亡誘導(dǎo)和抗增殖活性而被用于治療癌癥。例如，根皮素誘導(dǎo)NSCLC A549細胞的凋亡[16]?？鄥A通過激活p38促進非小細胞肺癌細胞凋亡[17]。這些天然化合物有效地限制了惡性腫瘤的增殖，副作用小。

本研究中使用的蘆薈苷是一種從蘆薈中提取的天然化合物，已被證實在各種類型的惡性腫瘤中具有有效作用[17]。先前的研究證明，蘆薈苷通過抑制血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)受體2和STAT3磷酸化的活化[18]，可以顯著抑制體外人臍靜脈內(nèi)皮細胞(Human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)的增殖，遷移和脈管形成。同樣，在本研究中，蘆薈苷有效地抑制細胞生長和增殖標志物(Ki-67和PCNA)的表達，特別是在較高濃度(50和100 μmol/L)時。這些結(jié)果表明蘆薈苷可以抑制非小細胞肺癌細胞的存活能力。

相應(yīng)的研究已經(jīng)報道了蘆薈苷的抗腫瘤存作用。有報道表明，蘆薈和化療聯(lián)合應(yīng)用可以提高腫瘤消退率和生存期的有效性[19]。有研究指出，蘆薈苷和大黃素聯(lián)用可以通過線粒體膜電位破壞促進人U87惡性膠質(zhì)瘤細胞的細胞周期阻滯和凋亡行為進展[20]。在本研究中，用蘆薈苷處理的肺癌A549細胞的細胞活力大大降低，隨著濃度的增加，抑制率增加。此外，蘆薈苷可以提升A549細胞的凋亡率，誘導(dǎo)G2/M期的積累。這與之前Alshatwi等[21]研究蘆薈苷與細胞凋亡相關(guān)蛋白(caspase-3、caspase-8和caspase-9)的表達增加以及細胞周期關(guān)卡蛋白(p27、p53和細胞周期蛋白A)水平的改變趨勢相一致，進一步證實了蘆薈苷在A549細胞中的活性作用。上述結(jié)果表明，蘆薈苷可以通過抑制非小細胞肺癌細胞的增殖，誘導(dǎo)細胞凋亡和G2/M期細胞周期阻滯，從而抑制非小細胞肺癌細胞活性。同時蘆薈苷也被認為具有抗轉(zhuǎn)移作用。本研究得出了類似的結(jié)論。在蘆薈苷處理下，A549細胞的侵襲和遷移能力受到很大的抑制。前述實驗檢測在用蘆薈苷處理的A549細胞中，腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白(MMP-2、MMP-9、MMP-14和VEGF)的水平也降低，特別是在更高濃度(50和100 μmol/L)時[22]，以上結(jié)果提示了蘆薈苷對非小細胞肺癌運動的整體抑制作用。

同時蘆薈苷在體內(nèi)也表現(xiàn)出腫瘤抑制作用。蘆薈苷已被報道可以直接抑制前列腺癌細胞在無胸腺裸鼠模型中的生長[23]。體內(nèi)研究注射人HER-2模擬物后，裸鼠腫瘤中顯示蘆薈苷抗腫瘤活性的陽性結(jié)果，證實蘆薈苷可以明確抑制乳腺癌細胞的增殖生長[24]。在高轉(zhuǎn)移性黑色素瘤B16-F10細胞中也觀察到蘆薈苷可以抑制黑色素瘤細胞的轉(zhuǎn)移侵襲行為[25]。在這項研究中，有效的蘆薈苷濃度可以干擾異種移植物中的腫瘤形成和腫瘤體積。此外，蘆薈苷也可以抑制增殖標志物(Ki-67和PCNA)的表達水平，針對轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白(MMP-9和VEGF)的表達水平尚未進行梯度濃度實驗，后續(xù)實驗可以進一步探討相關(guān)轉(zhuǎn)移通路途徑和蘆薈苷之間的關(guān)聯(lián)，明確A549細胞凋亡及G2/M期細胞周期阻滯與細胞侵襲行為之間的相互關(guān)聯(lián)。此外，蘆薈苷通過抑制細胞運動，干擾A549細胞的侵襲和遷移能力及其水平可能是通過細胞骨架的轉(zhuǎn)變形成，甚至可能通過抑制p38MAPK/Cdc25B/Hsp27途徑參與肺癌的轉(zhuǎn)移過程[26]。

綜上所述，適合濃度的蘆薈苷可以抑制非小細胞肺癌的增殖和侵襲行為，通過前面實驗的結(jié)果，蘆薈苷可能干擾病理狀態(tài)下非小細胞肺癌的疾病進展，破壞A549細胞發(fā)生發(fā)展的必需途徑，可能引起部分腫瘤細胞的轉(zhuǎn)變，有可能為非小細胞肺癌的早期診斷和進展提供參考意見。