吳 克 邱明星 王 寓

(西南醫(yī)科大學臨床醫(yī)學院，瀘州646000)

膀胱癌是世界第九大常見惡性腫瘤，據(jù)統(tǒng)計，全球每年約有386 000例膀胱癌新發(fā)病例，并且其具有較高的復(fù)發(fā)率，導致多數(shù)患者預(yù)后較差[1-3]。膀胱癌預(yù)后的好壞與癌癥的發(fā)展階段密切相關(guān)，但多數(shù)患者由于在膀胱癌早期沒有明顯癥狀而延誤治療[4-6]。因此，尋找新的診斷指標和治療方法是改善膀胱癌患者預(yù)后的關(guān)鍵。非編碼RNA是一類不具有蛋白質(zhì)編碼功能的RNA，根據(jù)RNA大小可分為長鏈非編碼RNA和短鏈非編碼RNA兩類[7,8]。近年來研究表明，非編碼RNA在癌癥的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用[9-12]。其中，長鏈非編碼RNA HNF1A-AS1參與了膀胱癌的發(fā)生發(fā)展。研究表明，HNF1A-AS1可通過靶向調(diào)控miR-30b-5p促進膀胱癌細胞增殖[13]。短鏈非編碼RNA miR-1過表達能明顯抑制膀胱癌細胞增殖并降低癌細胞運動能力[14]。并且生物信息預(yù)測發(fā)現(xiàn)HNF1A-AS1和miR-1之間可能存在靶向關(guān)系，但HNF1A-AS1和miR-1兩者在調(diào)控膀胱癌細胞增殖和侵襲過程中是否存在靶向調(diào)控關(guān)系還未見報道。因此，本文將探究沉默HNF1A-AS1對膀胱癌細胞增殖及侵襲的作用及其與miR-1的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1材料 膀胱癌細胞系HT-1376、RT112、253J和正常泌尿道上皮細胞系SV-HUC-1購自中國科學院上海細胞庫；實驗所用的HNF1A-AS1 shRNA、miR-1 mimic和miR-1 inhibitor均購自美國Invitrogen公司；MEM培養(yǎng)液、DMEM培養(yǎng)液、胰酶和胎牛血清均購自美國Gibco公司；Matrigel基質(zhì)膠購自美國BD公司；細胞轉(zhuǎn)染試劑盒購自美國Invitrogen公司；Dual Luciferase報告基因試劑盒購自美國Promega公司；TRIzol試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量試劑盒購自美國ThermoFisher公司；MTT試劑盒和BCA試劑盒購自碧云天生物科技公司；Ki67、增殖細胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(Matrix metalloproteinase-9,MMP-9)和內(nèi)皮細胞生長因子(Endothelial cell growth factor,VEGF) 一抗及HRP標記的山羊抗小鼠二抗均購自英國Abcam公司；半干轉(zhuǎn)膜儀、PCR儀和電泳儀購自Bio-Rad公司；酶標儀購自德國BMG Labtech公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) HT-1376細胞用含有10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。RT112、253J和SV-HUC-1細胞用含10%的DMEM培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，隔天換液，細胞匯合率達到80%時進行傳代。

1.2.2細胞轉(zhuǎn)染 將253J細胞傳代培養(yǎng)于6孔板中，培養(yǎng)24 h后，用慢病毒轉(zhuǎn)染HNF1A-AS1，并根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑盒說明書用Lip 3000分別或同時轉(zhuǎn)染HNF1A-AS1 shRNA、miR-1 mimic或miR-1 inhibitor，轉(zhuǎn)染48 h后用熒光定量進行檢測。

1.2.3MTT檢測細胞活性 將細胞傳代接種于96孔板中并隨機分為miR-1 mock組、HNF1A-AS1 shRNA組、miR-1 inhibitor組和shRNA+ miR-1 inhibitor組，用miR-1 inhibitor和shRNA分別或同時進行轉(zhuǎn)染后，每孔加入20 μl MTT試劑于37℃繼續(xù)孵育4 h后，加入150 μl DMSO，充分混勻后用酶標儀檢測細胞吸光度。

1.2.4侵襲實驗 將細胞用無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后，以2×105個/ml的濃度將細胞接種于提前用Matrigel預(yù)包被的Transwell小室中，用無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)，小室下層加入含血清的正常培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h后用棉簽擦去上層細胞，用結(jié)晶紫對下層細胞進行染色并統(tǒng)計。

1.2.5熒光素酶報告實驗 通過生物信息學預(yù)測HNF1A-AS1在miR-1上的結(jié)合位點。PCR擴增miR-1中含有HNF1A-AS1結(jié)合位點的片段，并將該片段插入pMIR-REPORT載體。用miR-1野生型質(zhì)粒、miR-1突變型質(zhì)粒和HNF1A-AS1分別或同時轉(zhuǎn)染細胞后，根據(jù)Dual Luciferase報告基因試劑盒說明書測定熒光強度，并以突變質(zhì)粒作對照。

1.2.6熒光定量檢測 用TRIzol試劑盒提取各組細胞總RNA。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，對cDNA進行擴增后用熒光定量試劑盒對其進行定量分析。以GAPDH為內(nèi)參，實驗所用的引物序列如下：HNF1A-AS1上游引物：5′-TCAAGAAATGGT-GGCTAT-3′，下游引物：5′-GATCTGA-GACTGG-CTGAA-3′；miR-1上游引物：5′-GATCCCCTGGAATGTAAAGAAGTATGTATTTCAAGAGAATACATACTTCTT-TACATTCCATTTTTA-3′， miR-1下游引物：5′-TCGATAAAAATGGAATGTAAAGAAGTATGTATTCT-CTTGAAATACATACTTCTTTACATTCCAGGG-3′；GA-PD-H上游引物：5′-ACAGTCAGCCGCATCTTCTT-3′，下游引物：5′-GACAAGCTTCCCTT-CTCAG-3′。

1.2.7免疫印跡 用RIPA裂解液提取各組細胞總蛋白。用BCA試劑盒檢測蛋白濃度后調(diào)平。用10%SDS-PAGE分離蛋白并轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜。用5%脫脂牛奶室溫封閉蛋白2 h后，加入一抗4℃封閉過夜。第二天棄去一抗并洗滌3次后加入相應(yīng)二抗，室溫孵育1 h。最后滴加ECL顯色液于暗室曝光顯影，用Image J軟件對蛋白質(zhì)條帶進行定量分析，以GAPDH為內(nèi)參。

2 結(jié)果

2.1HNF1A-AS1和miR-1在膀胱癌細胞系中的表達 為了探究HNF1A-AS1、miR-1與膀胱癌的關(guān)系，我們首先檢測了HNF1A-AS1和miR-1在多種膀胱癌細胞系中的表達情況。與正常泌尿道上皮細胞比較，膀胱癌細胞系HT-1376、RT112和253J的HNF1A-AS1 mRNA表達水平明顯升高(P<0.01，圖1)，miR-1表達水平明顯降低(P<0.01，圖1)，并且以253J細胞變化最顯著。因此，選其進行后續(xù)實驗。

2.2HNF1A-AS1對miR-1表達的影響 實驗結(jié)果表明，HNF1A-AS1過表達可顯著降低膀胱癌細胞miR-1的表達水平，還可顯著減弱miR-1 mimic對miR-1表達的促進作用(P<0.05，圖2A)。此外，下調(diào)HNF1A-AS1表達可顯著促進235J細胞miR-1的表達(P<0.05)，并能明顯減弱miR-1 inhibitor對miR-1表達的抑制作用(P<0.05，圖2B)，表明HNF1A-AS1可影響膀胱癌細胞miR-1的表達。

2.3HNF1A-AS1靶向結(jié)合miR-1 為了探究HNF1A-AS1和miR-1之間是否存在靶向關(guān)系，我們通過生物信息預(yù)測了兩者之間的靶向關(guān)系。如圖3所示，miR-1基因序列上存在連續(xù)的HNF1A-AS1的結(jié)合位點。熒光素酶報告實驗進一步表明，HNF1A-AS1過表達能顯著減弱帶有miR-1片段野生型質(zhì)粒的熒光素酶活性(P<0.05，圖3)，結(jié)合位點突變后，調(diào)控關(guān)系消失，表明HNF1A-AS1和miR-1之間存在靶向調(diào)控關(guān)系。

2.4沉默HNF1A-AS1對膀胱癌細胞增殖的影響MTT實驗結(jié)果表明，與miR-1 mock組比較，miR-1 inhibitor組細胞活性明顯增高，shRNA組細胞活性明顯降低(P<0.05，圖4)；與shRNA組比較，shRNA+miR-1 inhibitor組細胞活性明顯升高(P<0.05，圖4)；同時，沉默HNF1A-AS1表達能顯著抑制膀胱癌細胞增殖相關(guān)蛋白Ki67和PCNA的表達(P<0.05，圖5)，抑制miR-1表達可明顯促進Ki67和PCNA表達(P<0.05，圖5)， 并可顯著減弱shRNA對Ki67和PCNA表達的抑制作用(P<0.05，圖5)。

圖1 HNF1A-AS1和miR-1在膀胱癌細胞系中的表達Fig.1 Expressions of HNF1A-AS1 and miR-1 in bladder cell linesNote: n=6,**.P<0.01 versus SV-HUC-1 group.

圖2 HNF1A-AS1對miR-1表達的影響Fig.2 Effects of HNF1A-AS1 on expression of miR-1Note: n=6.*.P<0.05.

2.5沉默HNF1A-AS1對膀胱癌細胞侵襲能力的影響 與miR-1 mock組比較，shRNA組膀胱癌細胞侵襲相關(guān)蛋白MMP-9和VEGF的蛋白表達水平顯著降低(P<0.05，圖5)，miR-1 inhibitor組MMP-9和VEGF表達水平明顯升高(P<0.05，圖5)；與shRNA組比較，shRNA + miR-1 inhibitor組MMP-9和VEGF表達水平明顯升高(P<0.05，圖5)。此外，shRNA組細胞侵襲數(shù)較miR-1 mock組明顯減少(P<0.05，圖6)，miR-1 inhibitor組細胞侵襲數(shù)明顯增多(P<0.05，圖6)；與shRNA組比較，shRNA + miR-1 inhibitor組細胞侵襲數(shù)顯著增多(P<0.05，圖6)。

圖3 HNF1A-AS1靶向結(jié)合miR-1Fig.3 HNF1A-AS1 targeted combinates with miR-1Note: n=6,*.P<0.05 versus hsa-miR-1 wt group.

圖4 沉默HNF1A-AS1對膀胱癌細胞增殖的影響Fig.4 Effect of silencing HNF1A-AS1 on cell proliferation of bladder cancer cells Note: Cells were transferred with shRNA and miR-1 inhibitor and cell viability was measured by MTT.n=6,*.P<0.05 versus miR-1 mock,#.P<0.05 versus shRNA.

圖5 沉默HNF1A-AS1對膀胱癌細胞增殖和侵襲相關(guān)蛋白表達的影響Fig.5 Effects of silencing HNF1A-AS1 on cell prolifer-ation-and invasion-related proteins of bladd-er cancerNote: GAPDH was used as loading control,n=6.*.P<0.05,**.P<0.05,versus miR-1 mock group；#.P<0.05 versus shRNA group.

圖6 沉默HNF1A-AS1對膀胱癌細胞侵襲能力的影響Fig.6 Effect of silencing HNF1A-AS1 on cell invasion of bladder cells Note: n=6,*.P<0.05 versus miR-1 mock group；#.P<0.0 versus shRNA group.

3 討論

非編碼RNA是指一類不參與蛋白質(zhì)編碼的RNA，根據(jù)其大小可分為長鏈非編碼RNA和短鏈非編碼RNA[15]。既往研究發(fā)現(xiàn)，非編碼RNA具有多種生物學功能，其可調(diào)控基因、蛋白質(zhì)表達和機體的能量代謝，同時也參與了癌癥的發(fā)生和發(fā)展[15-17]。研究表明，非編碼長鏈RNA HNF1A-AS1在多種癌癥中呈高表達狀態(tài)，其與癌癥患者的預(yù)后呈負相關(guān)[18-20]。而miR-1在多種癌癥中呈低表達狀態(tài)[21-23]。在本研究中，首先檢測了HNF1A-AS1和miR-1在多種膀胱癌細胞系中的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HNF1A-AS1在多種膀胱癌細胞系中的mRNA表達水平均高于正常泌尿道上皮細胞，miR-1的表達水平均低于正常泌尿道上皮細胞，并且以253J細胞HNF1A-AS1和miR-1的表達變化最大，因此選擇253J細胞系進行后續(xù)實驗。

研究表明長鏈非編碼RNA HNF1A-AS1可通過調(diào)控多種非編碼RNA的表達影響癌癥的發(fā)生和發(fā)展。HNF1A-AS1可通過上調(diào)長鏈非編碼RNA H19的表達誘導食管癌的發(fā)生[24]，其還可通過抑制miR-34a下調(diào)SIRT1/p53反饋回路促進結(jié)腸癌細胞的轉(zhuǎn)移[20]。也有研究報道表明，HNF1A-AS1還可通過下調(diào)miR-30b-5p誘導凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2表達，從而促進肝癌細胞和膀胱癌細胞增殖、抑制癌細胞凋亡，促進癌癥的發(fā)生發(fā)展[13,19]。miR-1是一類抑癌基因，其過表達可降低膀胱癌細胞的增殖和侵襲能力[25]。但HNF1A-AS1是否可通過靶向調(diào)控miR-1的表達影響癌癥的發(fā)展還未見報道。本文研究發(fā)現(xiàn)，HNF1A-AS1過表達可顯著抑制膀胱癌細胞miR-1的表達，還可顯著減弱miR-1 mimic誘導miR-1表達的作用。沉默HNF1A-AS1可促進膀胱癌細胞miR-1表達，減弱miR-1 inhibitor對miR-1表達的抑制作用，提示HNF1A-AS1和miR-1之間可能存在靶向調(diào)控關(guān)系。為了進一步驗證HNF1A-AS1和miR-1之間的關(guān)系，本文首先通過生物信息系統(tǒng)預(yù)測了HNF1A-AS1和 miR-1之間的靶向關(guān)系。結(jié)果表明，miR-1基因序列上存在HNF1A-AS1的結(jié)合位點，并且熒光素酶報告實驗結(jié)果也表明HNF1A-AS1和 miR-1之間存在靶向調(diào)控關(guān)系，提示HNF1A-AS1可能通過調(diào)控miR-1的表達影響膀胱癌的發(fā)展。

HNF1A-AS1過表達可增強膀胱癌細胞的增殖和運動能力，miR-1可通過調(diào)控長鏈非編碼RNA UCA1的表達抑制膀胱癌細胞增殖、促進癌細胞凋亡[13,14,26]。在上述實驗中，上文已經(jīng)證明HNF1A-AS1可靶向調(diào)控miR-1，因此，本文進一步探究了HNF1A-AS1對膀胱癌細胞增殖和侵襲能力影響與其調(diào)控miR-1表達的關(guān)系。通過實驗發(fā)現(xiàn)，沉默HNF1A-AS1表達能顯著抑制253J細胞活性，并可顯著抑制Ki67和PCNA的表達，下調(diào)miR-1表達可提高膀胱癌細胞活性，促進Ki67、PCNA表達，與之前文獻報道一致[13,14]。同時，miR-1 inhibitor還可顯著減弱shRNA對細胞增殖的抑制作用，表明沉默HNF1A-AS1可通過靶向調(diào)控miR-1表達抑制膀胱癌細胞增殖。此外，shRNA還可顯著抑制膀胱癌細胞侵襲、MMP-9和VEGF的表達，miR-1 inhibitor可明顯減弱shRNA對癌細胞侵襲和相關(guān)蛋白表達的抑制作用。MMP-9是基質(zhì)金屬蛋白酶家族一員，主要參與細胞基質(zhì)的降解，促進細胞轉(zhuǎn)移[27]。VEGF主要參與新血管的形成，也能通過促進細胞外基質(zhì)的降解促進細胞轉(zhuǎn)移[28]。實驗結(jié)果表明，沉默HNF1A-AS1可通過上調(diào)miR-1表達降低膀胱癌細胞侵襲能力。

綜上所述，HNF1A-AS1可靶向調(diào)控膀胱癌細胞miR-1的表達，沉默HNF1A-AS1可通過誘導miR-1表達減弱癌細胞增殖和侵襲能力。本研究進一步探究了HNF1A-AS1影響膀胱癌發(fā)展的機制，可能為膀胱癌的治療提供了新的思路。