李慧敏 王曉霞 武美麗 金莉婭 苗麗娟 孫 禮

(甘肅省婦幼保健院生殖內(nèi)分泌科，蘭州730050)

宮頸癌是常見的女性惡性腫瘤之一，近些年的發(fā)病率上升，且呈現(xiàn)出年輕化的趨勢，給女性的生命健康造成嚴重的威脅[1]。宮頸癌的發(fā)生發(fā)展是一個多階段、多基因調(diào)控的復雜過程，涉及表觀遺傳學和免疫學改變、癌基因的激活和抑癌基因失活等，因此，尋找有效的宮頸癌診療靶點具有重要意義。神經(jīng)纖毛蛋白(Neuropilin，NRP)是一種細胞膜表面的跨膜糖蛋白，因在神經(jīng)發(fā)育方面的作用而被認識，也因此而得名，有NRP1和NRP2兩個成員，NRP1主要在神經(jīng)細胞、腫瘤細胞和血管內(nèi)皮細胞等的細胞膜表面表達，屬于非酪氨酸激酶輔助受體，是VEGF的共受體，能夠與其結(jié)合促進血管新生及腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移[2,3]。已有研究顯示，多種惡性腫瘤中NRP1出現(xiàn)過表達，如肺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌等，其高表達可促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展[4-6]。目前NRP1在宮頸癌中的研究相對較少，有研究顯示，宮頸癌中NRP1的表達升高，其高表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期有關(guān)[7]，但關(guān)于NRP1對宮頸癌生物學特性的影響及機制研究尚未清楚。Wnt信號通路是一類保守的信號通路，與包括宮頸癌在內(nèi)的多種腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其激活可促進腫瘤發(fā)展[8]。本研究通過RNA干擾技術(shù)沉默宮頸癌細胞中NRP1的表達，試圖研究其對癌細胞活力、凋亡、免疫抑制因子表達及Wnt信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1主要材料、試劑和儀器 人正常宮頸細胞Ect1/E6E7 及宮頸癌Hela、CaSki、SiHa、HCC94細胞均購自中科院上海細胞庫；DMEM培養(yǎng)基、雙抗均購自美國Gibco；胰蛋白酶購自南京凱基生物；NRP-1、TGF-β1、Wnt1、β-catenin、Survivin、Cyclin D1抗體均購自美國Abcam；CCK8試劑盒購自DoJINDO；Bradford試劑盒、Annexin V-FITC/PI細胞凋亡試劑盒、ECL發(fā)光試劑盒均購自碧云天生物；脂質(zhì)體LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen；DCFH-DA購自美國Sigma；酶標儀購自美國Thermo；流式細胞儀購自美國BIO-RAD。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) Ect1/E6E7、Hela、CaSki、SiHa和HCC94細胞用DMEM培養(yǎng)液(含有10%小牛血清及雙抗)，置于5%體積分數(shù)的CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)。每兩天將細胞培養(yǎng)基更換一次，胰酶消化后傳代。后續(xù)實驗選擇生長至對數(shù)期的細胞。

1.2.2細胞轉(zhuǎn)染 NRP-1的特異性干擾序列(NRP-1-siRNA)及無意義siRNA系列(NC-siRNA組)均委托廣州銳博生物設(shè)計并合成，通過LipofectamineTM2000進行瞬時轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前一天以每孔1 ml細胞懸液(約1×105個細胞)接種CaSki細胞于6孔板，細胞達60%生長密度時，換為無血清和抗生素的培養(yǎng)液，參照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染說明將NRP-1-siRNA和NC-siRNA轉(zhuǎn)染CaSki細胞，轉(zhuǎn)染濃度為100 nmol/L，并設(shè)置空白對照組(Control組)，僅加入脂質(zhì)體，轉(zhuǎn)染過程嚴格參照轉(zhuǎn)染說明，轉(zhuǎn)染后于5%體積分數(shù)的CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)5～6 h，換為含血清和無抗生素培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，通過Western blot檢測轉(zhuǎn)染后的細胞中NRP-1的蛋白表達。

1.2.3Western blot 在生長至對數(shù)期的Ect1/E6E7、Hela、CaSki、SiHa和HCC94細胞及轉(zhuǎn)染NRP-1-siRNA后48 h的CaSki細胞中加入適量的細胞裂解液，置于冰上反應30 min，離心收集總蛋白。Bradford試劑盒測定蛋白濃度；蛋白與上樣緩沖液充分混勻后于100℃變性5 min，加50 μg變性蛋白在每孔道中行SDS-PAGE分離，電泳結(jié)束后切下目的膠轉(zhuǎn)PVDF膜，將轉(zhuǎn)好的膜在5%濃度的脫脂奶粉中封閉2 h，洗膜，4℃孵育稀釋好的NRP-1、TGF-β1、Wnt1、β-catenin、Survivin、Cyclin D1抗體過夜，洗膜，加入二抗，室溫孵育1 h，洗膜，ECL顯色，化學發(fā)光儀內(nèi)曝光并保存圖像。

1.2.4CCK8法檢測細胞活力 以每孔中100 μl(1×105ml-1)接種生長至對數(shù)期的CaSki細胞于96孔板，常規(guī)培養(yǎng)24 h后將NRP-1-siRNA和NC-siRNA轉(zhuǎn)染CaSki細胞，并設(shè)置空白對照組(Control組)，每組均設(shè)置5個復孔，于轉(zhuǎn)染的48 h在每個待測孔中加入CCK8試劑10 μl，培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1 h，酶標儀測定450 nm吸光度值(OD值)，以O(shè)D值反映細胞活力，可以間接反映出細胞的增殖能力。實驗重復3次。

1.2.5流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率 細胞凋亡率檢測使用Annexin V-FITC和PI進行熒光染色，通過流式細胞儀檢測。收集轉(zhuǎn)染48 h的細胞，PBS洗滌細胞，胰酶消化后將細胞懸浮于500 μl的Binding緩沖液中，混勻后加入5 μl的Annexin V-FITC和5 μl 的PI，室溫避光環(huán)境孵育10～15 min，上機，流式細胞儀檢測。實驗重復3次。

1.2.6流式細胞術(shù)檢測ROS含量 PBS洗滌細胞，細胞懸浮于含DCFH-DA(終濃度為10 μmol/L)的無血清培養(yǎng)液中，37℃孵育20 min，以無血清的培養(yǎng)基洗滌細胞，將沒有進入細胞的DCFH-DA去除掉，流式細胞儀檢測熒光強度(激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為488 nm和525 nm)，由于熒光強度與細胞內(nèi)的ROS水平呈現(xiàn)出正相關(guān)，因此可以熒光強度大小反應細胞內(nèi)ROS的水平。實驗重復3次。

2 結(jié)果

2.1NRP-1在宮頸癌細胞表達 以人正常宮頸細胞Ect1/E6E7 為對照細胞，Western blot檢測宮頸癌Hela、CaSki、SiHa、HCC94細胞NRP-1的蛋白表達，結(jié)果如圖1所示，Ect1/E6E7、Hela、CaSki、SiHa、HCC94細胞NRP-1的蛋白表達分別為(0.092±0.010)、(0.245±0.032)、(0.473±0.041)、(0.337±0.038)、(0.316±0.033)，NRP-1在宮頸癌細胞的表達均顯著高于在Ect1/E6E7 細胞中的表達(P<0.05)。

2.2NRP-1-siRNA轉(zhuǎn)染CaSki細胞效果 NRP-1-siRNA轉(zhuǎn)染CaSki細胞48 h， Western blot檢測轉(zhuǎn)染后的細胞中NRP-1的蛋白表達，結(jié)果如圖2所示，Control組、NC-siRNA組和NRP-1-siRNA組NRP-1的蛋白表達分別為(0.312±0.032)、(0.324±0.036)、(0.090±0.009)，NRP-1-siRNA組NRP-1的表達顯著低于對照組(P<0.05)，而在NC-siRNA組的表達與對照組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

圖1 NRP-1在宮頸癌細胞表達Fig.1 NRP-1 expression in cervical cancer cellsNote: A.Western blot was used to detect the expression of NRP-1 in cervical cancer cells;B.The relative expression of NRP-1 protein in cervical cancer cells;compared with Ect1/E6E7 cells,*.P<0.05.

圖2 NRP-1-siRNA轉(zhuǎn)染CaSki細胞后NRP-1的蛋白表達Fig.2 Protein expression of NRP-1 after NRP-1-siRNA was transfected into CaSki cellsNote: A.The protein expression of NRP-1 in CaSki cells transfected with NRP-1-siRNA were detected by Western blot;B.The relative expression of NRP-1 protein;compared with the Control group,*.P<0.05.

2.3NRP-1-siRNA轉(zhuǎn)染降低CaSki細胞活力及誘導細胞凋亡 各組細胞活力及凋亡率檢測結(jié)果如圖3所示，Control組、NC-siRNA組和NRP-1-siRNA組的OD值分別為(0.683±0.065)、(0.669±0.062)、(0.321±0.037)，凋亡率分別為(2.01±0.32)%、(2.12±0.38)%、(11.83±0.87)%，與對照組比較，NRP-1-siRNA組細胞活力顯著降低(P<0.05)，細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)。

2.4NRP-1-siRNA轉(zhuǎn)染誘導CaSki細胞ROS產(chǎn)生 通過流式細胞儀檢測各組細胞中相對熒光強度，由于熒光強度與細胞內(nèi)的ROS水平呈現(xiàn)出正相關(guān)，因此可以熒光強度大小反應細胞內(nèi)ROS的水平，結(jié)果如圖4所示，Control組、NC-siRNA組和NRP-1-siRNA組ROS水平分別為(16.6±1.02)、(18.1±1.11)、(34.3±1.85)，與對照組比較，NRP-1-siRNA組ROS水平顯著升高(P<0.05)。

2.5NRP-1-siRNA轉(zhuǎn)染降低CaSki細胞免疫抑制因子TGF-β1表達 Western blot檢測各組細胞中免疫抑制因子TGF-β1表達，結(jié)果如圖5所示，Control組、NC-siRNA組和NRP-1-siRNA組TGF-β1的蛋白表達分別為(0.362±0.042)、(0.374±0.045)、(0.153±0.016)，與對照組比較，NRP-1-siRNA組TGF-β1的表達顯著降低(P<0.05)。

圖3 NRP-1-siRNA轉(zhuǎn)染對CaSki細胞活力及細胞凋亡的影響Fig.3 Effect of NRP-1-siRNA transfection on viability and apoptosis in CaSki cellNote: A.The OD value of each cell;B.The results of cell apoptosis detection in each group;C.Cell apoptosis rate in each group;compared with Control group,*.P<0.05.

圖4 NRP-1-siRNA轉(zhuǎn)染對CaSki細胞ROS含量的影響Fig.4 Effect of NRP-1-siRNA transfection on the content of ROS in CaSki cellsNote: Compared with the Control group,*.P<0.05.

圖5 NRP-1-siRNA轉(zhuǎn)染對CaSki細胞免疫抑制因子TGF-β1表達的影響Fig.5 Effect of NRP-1-siRNA transfection on the expression of immunosuppressive factor TGF-β1 in CaSki cellNote: A.Western blot was used to detect the protein expression of TGF-β1;B.The relative expression of TGF-β1 protein;compared with the Control group,*.P<0.05.

2.6NRP-1-siRNA轉(zhuǎn)染下調(diào)Wnt信號通路表達 Western blot檢測Wnt信號通路相關(guān)蛋白Wnt1、β-catenin、Survivin、Cyclin D1的蛋白表達，結(jié)果如圖6所示，Control組、NC-siRNA組和NRP-1-siRNA組Wnt1的蛋白表達分別為(0.756±0.075)、(0.773±0.072)、(0.192±0.023)，β-catenin的蛋白表達分別為(0.342±0.034)、(0.359±0.036)、(0.123±0.015)，Survivin的蛋白表達分別為(0.187±0.021)、(0.177±0.020)、(0.103±0.013)，Cyclin D1的蛋白表達分別為(0.211±0.018)、(0.205±0.019)、(0.148±0.013)，與對照組比較，NRP-1-siRNA組Wnt1、β-catenin、Survivin、Cyclin D1的蛋白表達均顯著降低(P<0.05)。

圖6 NRP-1-siRNA轉(zhuǎn)染對Wnt信號通路的影響Fig.6 Effect of NRP-1-siRNA transfection on Wnt signaling pathwayNote: A.Western blot was used to detect the expression of Wnt signaling pathway protein;B.The relative expression of Wnt signaling pathway protein;compared with Control group,*.P<0.05.

3 討論

RNA干擾技術(shù)是一種能有效沉默基因表達的方法，具有高度特異性、高效性及濃度和時間依賴性等特點，較其他傳統(tǒng)的基因沉默方法有著更多的優(yōu)勢，目前已成為基因治療、基因功能研究的一個重要工具[9-11]。在基因治療宮頸癌的研究中，采用RNA干擾技術(shù)特異的抑制一些原癌基因的表達可有效降低宮頸癌的發(fā)生發(fā)展[12,13]。NRP-1基因有廣泛的表達，在幾乎人類所有的惡性腫瘤組織中有表達，既可以在腫瘤細胞上直接分布，也可在腫瘤血管內(nèi)皮細胞上分布，在多種腫瘤中出現(xiàn)過表達，其過表達可增加腫瘤的發(fā)生發(fā)展，而也有研究發(fā)現(xiàn)通過RNA干擾技術(shù)抑制NRP-1的表達可降低腫瘤的發(fā)生發(fā)展[14,15]。乳腺癌中通過RNA干擾技術(shù)抑制NRP-1的表達可降低癌細胞的增殖和誘導細胞凋亡，并提高其對表柔比星的敏感性，而過表達反之；RNA干擾沉默腦膠質(zhì)瘤中NRP-1的表達后可抑制細胞增殖，促進細胞凋亡和阻滯細胞周期[16]。NRP-1對宮頸癌的影響研究尚未清楚。有研究顯示，宮頸癌中NRP1的表達升高，其高表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與臨床分期有關(guān)[7]。因此本試驗旨在研究NRP1對宮頸癌細胞生物學特性的影響。

本研究首先檢測不同宮頸癌細胞中NRP1的表達，發(fā)現(xiàn)CaSki細胞中NRP1的表達最高，因此選擇其作為研究對象，通過RNA干擾技術(shù)抑制CaSki細胞NRP1的表達，發(fā)現(xiàn)NRP1-siRNA組NRP1的表達明顯降低，說明可用于后續(xù)實驗研究。CCK8法及流式細胞儀檢測的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NRP1-siRNA組細胞活力明顯降低，凋亡率升高。人體正常情況下，ROS產(chǎn)生與清除處于動態(tài)平衡，而一些病理因素，可打破其平衡，導致氧化應激的出現(xiàn)，多項研究表明，ROS產(chǎn)生與多種腫瘤細胞生長密切相關(guān)[17-20]。本研究的結(jié)果提示抑制宮頸癌中NRP1的表達可通過提高ROS含量誘導細胞凋亡。Wnt信號通路是一類保守的信號通路，目前Wnt信號經(jīng)典通路Wnt/β-catenin及下游的靶基因成為研究熱點。當Wnt被過度激活時可引起β-catenin大量積聚在細胞質(zhì)內(nèi)，可引起Survivin、Cyclin D1等下游與腫瘤相關(guān)靶基因的激活，從而導致癌細胞發(fā)生增殖過度，進而引起腫瘤的發(fā)生[21,22]。多項研究顯示，宮頸癌、腎癌等多種腫瘤中Wnt信號被激活，可促進其發(fā)生發(fā)展，而通過Wnt信號通路抑制劑抑制其表達可降低腫瘤的發(fā)生發(fā)展[23,24]。TGF-β在機體正常發(fā)育及腫瘤發(fā)生中有重要作用，有研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1具有重要的免疫抑制作用，其在宮頸癌中的大量分泌可逃脫免疫反應的攻擊[25]。宮頸癌中TGF-β1的表達升高，Wnt信號通路可通過促進TGF-β的表達而促進腫瘤血管生成，從而促進腫瘤發(fā)生發(fā)展[26]。本研究結(jié)果顯示，抑制宮頸癌NRP1的表達可降低Wnt信號通路Wnt1、β-catenin和下游靶基因Survivin、Cyclin D1及TGF-β1的表達。這提示NRP1可通過下調(diào)Wnt信號通路降低宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，抑制宮頸癌中NRP-1基因表達可降低癌細胞活力，誘導細胞凋亡，降低免疫抑制分子TGF-β1表達，其機制與提高細胞ROS水平和下調(diào)Wnt信號通路有關(guān)。該研究提示NRP-1可能對宮頸癌的防治具有一定的價值，但需更多的研究及臨床試驗作為支撐。