張 洋 冀 偉 周奧飛 常越辰 張 亮 馬克濤 李 麗 司軍強(qiáng) 王 洋

(石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理教研室，石河子832002)

腎臟缺血再灌注損傷(Ischemia reperfusion injury,IRI)通常發(fā)生在腎大部切除、腎移植和主動(dòng)脈-血管手術(shù)等臨床情況下，是造成急性腎衰竭(Acute renal failure,ARF)的常見(jiàn)原因，也是腎移植預(yù)后的重要影響因素[1]。以往研究發(fā)現(xiàn)，IRI作為一種急性的組織損傷病變，能夠刺激和興奮固有免疫系統(tǒng)，激活其中的抗原非特異性免疫細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞等)并產(chǎn)生相應(yīng)的免疫應(yīng)答反應(yīng)[2,3]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，作為經(jīng)典的適應(yīng)性免疫細(xì)胞——CD4+T淋巴細(xì)胞被認(rèn)為是連接固有免疫和適應(yīng)性免疫的重要橋梁，參與和介導(dǎo)了腎臟IRI[4-6]。CD4+T淋巴細(xì)胞不僅包括Th1和Th2細(xì)胞，還包括新定義的Th17和Treg細(xì)胞[7,8]，研究發(fā)現(xiàn)Th17/Treg的免疫穩(wěn)態(tài)破壞是很多自身免疫性和炎癥性疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素[9,10]。

類(lèi)固醇激素尤其是性激素在各種炎性疾病中發(fā)揮著重要作用[11,12]。人體和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已發(fā)現(xiàn)，女性比男性更易耐受由IRI引起的腎損傷，說(shuō)明雌激素在IRI引起的腎臟炎性過(guò)程中扮演著重要角色，且其作用機(jī)制復(fù)雜[13,14]。雌激素是否通過(guò)調(diào)節(jié)Th17/Treg的免疫平衡來(lái)抑制腎臟炎癥反應(yīng)，尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究將從Th17/Treg免疫平衡的角度，以去卵巢大鼠為研究對(duì)象，進(jìn)一步探討雌激素對(duì)腎臟IRI的免疫調(diào)控機(jī)制，為臨床上治療腎臟IRI提供新的研究思路。

1 材料與方法

1.1主要試劑和儀器 E2(Sigma,美國(guó))；紅細(xì)胞裂解液(BD,美國(guó))；FITC標(biāo)記的抗大鼠CD3單克隆抗體、APC標(biāo)記的抗大鼠CD4單克隆(eBioscience，美國(guó))；FACSAriaⅢ型流式細(xì)胞儀(BD,美國(guó))；大鼠IL-17 ELISA Kit、大鼠IL-10 ELISA Kit(Elabscience，中國(guó))。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 健康清潔級(jí)雌性SD大鼠24只，體質(zhì)量220～300 g，8～12周齡，由新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(許可證編號(hào) SCXK 新2003-0001)。購(gòu)進(jìn)大鼠后先進(jìn)行為期1周的適應(yīng)性飼養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度為20～25℃，濕度為50%～55%，所有大鼠均自由飲水?dāng)z食。24只雌性SD大鼠隨機(jī)分為4組：對(duì)照組(Control group)、去卵巢組(OVX group)、去卵巢后缺血再灌注損傷組(OVX+IRI group)和雌激素干預(yù)組(OE+IRI group)。

1.2.2模型制備 去卵巢模型制備和雌激素干預(yù)：將除Control group之外的18只SD大鼠以30 mg/L戊巴比妥(50 mg/kg)腹腔注射麻醉成功后，經(jīng)鼠背面切口切除雙側(cè)卵巢，手術(shù)后恢復(fù)14 d，在此期間要做好大鼠傷口的消毒和墊料清潔等工作，防止傷口感染。自術(shù)后14 d，將其中的6只SD大鼠皮下給予E2干預(yù)(100 μg/kg·d)，連續(xù)3 d，并做好標(biāo)記。

1.2.3腎臟缺血再灌注損傷模型制備 各組SD大鼠分別于末次給藥30 min后，再次用30 mg/L戊巴比妥(50 mg/kg)腹腔注射，麻醉成功后按照本實(shí)驗(yàn)室常用方法[15]切除右側(cè)腎臟，用無(wú)創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉左側(cè)腎蒂，持續(xù)缺血45 min后，恢復(fù)血流。各組分別于連續(xù)再灌注6 h后取血，剝離腎臟組織。

1.2.4全血生化指標(biāo)檢測(cè) 各組大鼠待腎臟缺血再灌注6 h后，予以30 mg/L的成巴比妥腹腔注射，麻醉成功后，行腹主動(dòng)脈穿刺取全血，送往石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科采用ROCHE羅氏COBASINTEGRA 800全自動(dòng)血生化分析儀進(jìn)行血尿素氮(Blood urea nitrogen,BUN)和血肌酐(Serum creatinine,SCr)檢測(cè)，評(píng)估其腎功能變化。

1.2.5腎臟病理學(xué)檢測(cè) 將再灌注6 h后剝離的腎臟組織經(jīng)固定、包埋、切片后行常規(guī)HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察腎臟組織病理形態(tài)學(xué)的變化，并由兩名專(zhuān)業(yè)的病理科醫(yī)師對(duì)其進(jìn)行Paller評(píng)分。

1.2.6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血CD3+CD4+T細(xì)胞變化 ①在5 ml EP管中分別加入100 ml抗凝全血，設(shè)立單標(biāo)管和同型對(duì)照管，加入抗體(FITC-CD3、APC-CD4、PE-CD25)1 μl，于常溫下避光孵育20 min。②加入1×紅細(xì)胞裂解液2 ml裂解紅細(xì)胞8～10 min。③裂紅結(jié)束后加入1 ml PBS終止裂解。③于1 000 r/min離心5 min，離心后棄掉上清，用500 μl的PBS重懸細(xì)胞后，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.7炎癥因子IL-17和IL-10的表達(dá) 取凍存于-20℃的血清樣品， ELISA法檢測(cè) IL-17 和 IL-10 表達(dá)水平，操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1雌激素對(duì)腎功能的影響 正常大鼠BUN和SCr的水平分別為(6.35±1.26) mmol/L和(30.27±4.82) μmol/L。OVX+IRI組BUN和SCr的水平升高，明顯高于OVX組(21.85±3.54 vs 7.15±1.41;115.16±13.27 vs 34.31±6.64)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。而OE+IRI組BUN和SCr的水平顯著降低，明顯低于OVX+IRI組(15.08±2.89 vs 21.85±3.54;68.89±12.65 vs 115.16±13.27)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.2雌激素對(duì)腎臟病理組織結(jié)構(gòu)的影響 HE病理染色顯示，Control組和OVX組腎小球腎小管清晰可見(jiàn)，未見(jiàn)明顯的形態(tài)學(xué)改變；OVX+IRI組近端及遠(yuǎn)端腎小管明顯擴(kuò)張，部分上皮細(xì)胞的核碎裂壞死、脫落，刷狀緣脫落，腎小管管腔阻塞，有大量的蛋白管型，腎小球血管管腔閉塞，腎間質(zhì)有大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；OE+IRI組腎小管輕度擴(kuò)張、細(xì)胞水腫、蛋白質(zhì)管型、腎間質(zhì)炎性浸潤(rùn)均明顯減輕，刷狀緣有損害但損害較輕(圖1A)。采用Paller評(píng)分方法計(jì)算腎臟病理組織評(píng)分[16]，結(jié)果顯示OVX+IRI組Paller評(píng)分顯著高于OVX組(45.67±2.99 vs 11.33±2.50)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；而OE+IRI組Paller評(píng)分顯著低于OVX+IRI組(31.17±3.96 vs 45.67±2.99)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)圖1B。

2.3雌激素對(duì)外周血中CD3+CD4+T細(xì)胞表達(dá)的影響 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，與OVX組比較，OVX+IRI組中CD3+CD4+T細(xì)胞的比例顯著增高(76.23±2.40 vs 64.95±5.42)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；經(jīng)雌激素補(bǔ)充治療后OE+IRI組中CD3+CD4+T細(xì)胞的比例顯著降低(69.75±2.56 vs 76.23±2.40)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)圖2。

表1各組大鼠血尿素氮和血肌酐的水平

Tab.1Bloodureanitrogenandserumcreatininelevelsineachgroup

GroupsBUN(mmol/L)SCr(μmol/L)Control6.35±1.2630.27±4.82OVX7.15±1.4134.31±6.64OVX+IRI21.85±3.542)115.16±13.272)OE+IRI15.08±2.891)2)68.89±12.651)4)

2.4雌激素對(duì)細(xì)胞因子IL-17和IL-10表達(dá)影響 OVX+IRI組大鼠血清中 IL-17的表達(dá)濃度顯著高于OVX組大鼠(1066.79±99.37 vs 434.09±162.69)pg/ml，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)， 而IL-10的表達(dá)濃度顯著低于OVX組大鼠(33.27±11.06 vs 81.47±24.29)pg/ml，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；經(jīng)雌激素補(bǔ)充治療后OE+IRI組中IL-17的濃度顯著降低(643.14±270.74 vs 1 066.79±99.37)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，而IL-10的濃度顯著升高(65.36±16.12 vs 33.27±11.06)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

2.5細(xì)胞因子IL-17和IL-10與腎臟損傷指標(biāo)的相關(guān)性分析如圖4A～C所示，腎臟缺血再灌注損傷中IL-17的表達(dá)水平與腎功能指標(biāo)BUN(r=0.691,P=0.000)、Scr(r=0.721,P=0.000)和腎小管Paller評(píng)分(r=0.769,P=0.000)均呈現(xiàn)正相關(guān)性。

圖1 各組大鼠腎臟組織病理學(xué)變化Fig.1 Renal histopathological changes of rats in each groupNote: A.Pathological images of kidney in each group(HE staining,bar:200 μm)；B.Paller score bar graph of HE staining of kidney in each group.*.P<0.05,**.P<0.01 vs OVX group；#.P<0.05 vs OVX+IRI

圖2 各組大鼠外周血中CD3+CD4+ T細(xì)胞的表達(dá)水平Fig.2 Expression of CD3+CD4+ T cells in peripheral blood of rats in each groupNote: A.Representative flow cytometric scatter plot of CD3+CD4+ T cell expression；B.Bar graph of the positive expression rate of CD3+CD4+ T cells in each group.*.P<0.05,**.P<0.01 vs OVX group；##.P<0.01 vs OVX+IRI

圖4 血清中炎癥因子IL-17和IL-10分別與BUN、SCr和Paller評(píng)分的相關(guān)性分析Fig.4 Correlation analysis of serum IL-17 and IL-10 levels with BUN,SCr and Paller scoresNote: The concentration of IL-17 were positively correlated with BUN(A),Scr(B) and (C)Paller score.The concentration of IL-10 were negatively correlated with BUN(D),Scr(E) and (F)Paller score.Each symbol represents a single individual(n=6).

圖3 ELISA檢測(cè)各組大鼠血清中IL-17和IL-10的表達(dá)水平Fig.3 Serum levels of IL-17 and IL-10 in each group were detected by ELISANote: A.IL-17 was measured in serum taken at 6 h post reperfusion；B.IL-10 was measured in serum taken at 6 h post reperfusion.*.P<0.05,**.P<0.01 versus OVX group；#.P<0.05,##.P<0.01 vs OVX+IRI

而IL-10的表達(dá)水平與腎功能指標(biāo)BUN(r=-0.603,P=0.002)、Scr(r=-0.519,P=0.009)和腎小管Paller評(píng)分(r=-0.556,P=0.005)均呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)性(圖4D～F)。

3 討論

腎臟IRI的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，涉及鈣超載、氧化應(yīng)激、微循環(huán)障礙、內(nèi)皮功能紊亂和過(guò)度炎癥反應(yīng)等[17]，目前在臨床上尚缺乏有效的防治手段。許多研究表明IRI存在性別差異，男性比女性更易發(fā)生IRI。流行病學(xué)和Meta分析顯示女性絕經(jīng)期后由于卵巢功能衰退，雌激素水平下降，較易發(fā)生心、腦、腎的IRI。因此，雌激素替代療法已經(jīng)成為一種新興的防治IRI的方法[18,19]。本研究采用經(jīng)典的圍絕經(jīng)期模型——去卵巢大鼠模型為研究對(duì)象，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，OVX+IRI組中BUN、SCr和腎小管Paller評(píng)分均高于OVX組；而補(bǔ)充雌激素至正常水平后，上述指標(biāo)均下降。說(shuō)明雌激素可以通過(guò)調(diào)節(jié)腎功能和改善腎組織損害程度對(duì)腎臟IRI起到保護(hù)作用，此結(jié)果與以往的研究一致[20]。

腎臟IRI是一種由適應(yīng)性免疫和固有免疫共同介導(dǎo)的炎性疾病[21]。有研究表明，CD4基因敲除的小鼠，可以耐受由IRI誘導(dǎo)的腎損傷，而CD8基因敲除的小鼠卻無(wú)此作用，由此可知CD4+T細(xì)胞是其致病的關(guān)鍵因素[22,23]。因此，靶向干預(yù)CD4+T細(xì)胞成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，腎臟IRI后外周循環(huán)中CD3+CD4+T細(xì)胞比例升高，腎臟損傷加劇。以往研究發(fā)現(xiàn)，雌激素可通過(guò)抗氧化、抗凋亡等途徑，減少再灌注區(qū)中性粒等細(xì)胞的浸潤(rùn)及炎癥因子的分泌，對(duì)腦、腎等器官的IRI具有保護(hù)作用[19,24]。本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)雌激素補(bǔ)充治療后，外周循環(huán)中CD3+CD4+T細(xì)胞比例降低，腎損傷減輕，說(shuō)明雌激素也可通過(guò)降低外周循環(huán)中的CD3+CD4+T細(xì)胞的表達(dá)從而減輕由IRI誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。然而CD4+T細(xì)胞亞群在腎臟缺血再灌注損傷中的作用及雌激素對(duì)CD4+T細(xì)胞亞群的影響尚不明確。

在炎癥因子的作用下，CD4+T淋巴細(xì)胞可分為不同種類(lèi)的輔助性T細(xì)胞。最初人們認(rèn)為在腎損傷時(shí)，Th1細(xì)胞被活化并加劇炎癥反應(yīng)，而Th2細(xì)胞則對(duì)腎急性損傷具有保護(hù)作用，Th1/Th2的平衡在腎臟IRI的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[25,26]。近年來(lái)汪泉等[27]研究發(fā)現(xiàn)，在一些腎損傷模型(如腎小球腎炎、狼瘡腎炎和IRI)中，外周循環(huán)中的Th17細(xì)胞及其細(xì)胞因子被激活[28]。Treg細(xì)胞是CD4+T淋巴細(xì)胞的另一種輔助性T細(xì)胞，可抑制過(guò)度免疫反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，CD4+CD25+Treg細(xì)胞可通過(guò)直接接觸或釋放抗炎細(xì)胞因子(如IL-10和TGF-β1)，來(lái)維持免疫耐受從而對(duì)抗由IRI誘發(fā)的腎臟炎性反應(yīng)[29]。此外，在肝臟IRI中，CD4+CD25+Treg細(xì)胞可通過(guò)負(fù)性調(diào)控Th17細(xì)胞的生成、功能及IL-17的分泌來(lái)發(fā)揮其抗炎作用[30]。眾多研究表明Th17/Treg的免疫平衡破壞是導(dǎo)致炎性免疫相關(guān)性疾病、自身免疫性疾病、中樞炎性疾病、器官移植等疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素[31]。本研究結(jié)果顯示：在OVX+IRI組中，Th17細(xì)胞所分泌的炎癥因子IL-17濃度升高，CD4+CD25+Treg所分泌的炎癥因子IL-10的濃度下降，提示Th17/Treg平衡存在失衡，腎損傷加劇。此外，相關(guān)性分析結(jié)果顯示：IL-17與腎損傷相關(guān)指標(biāo)呈現(xiàn)正相關(guān)性，IL-10則呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)性，提示該免疫平衡與腎臟IRI同步、關(guān)聯(lián)，此免疫調(diào)節(jié)失衡進(jìn)一步導(dǎo)致機(jī)體過(guò)度炎癥反應(yīng)的持續(xù)存在，使IRI的易感性增加。

Patil等[6]研究表明，減少I(mǎi)L-17細(xì)胞因子的分泌，能夠減弱心肌、肺及腎組織的IRI誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，提示靶向抑制Th17細(xì)胞，阻斷其細(xì)胞因子IL-17的分泌可減輕由IRI誘發(fā)的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)[32]。Koo等[30]研究發(fā)現(xiàn)，運(yùn)用P2X7受體拮抗劑可通過(guò)擴(kuò)增Treg的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)腎損傷的恢復(fù)。因此，通過(guò)對(duì)Th17/Treg多層面的免疫干預(yù)，維持Th17/Treg的免疫平衡，可能具有抑制由缺血腎組織誘發(fā)的局部炎癥及全身炎性反應(yīng)的作用，從而減輕腎臟IRI。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，雌激素可通過(guò)降低IL-17細(xì)胞因子的分泌，靶向抑制Th17細(xì)胞的活化，通過(guò)提升IL-10細(xì)胞因子的分泌，靶向激活CD4+CD25+Treg細(xì)胞，從而調(diào)節(jié)Th17/Treg的免疫平衡，降低由IRI誘導(dǎo)的炎性損傷。

綜上所述，腎缺血再灌注損傷后大鼠體內(nèi)可能存在著Th17/Treg穩(wěn)態(tài)的破壞，Th17/Treg免疫穩(wěn)態(tài)隨著腎損傷相關(guān)指標(biāo)變化而改變，表明該免疫穩(wěn)態(tài)與腎缺血再灌注損傷的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)；雌激素可通過(guò)調(diào)節(jié)和維持Th17/Treg的穩(wěn)態(tài)，有望成為治療腎臟IRI的新靶點(diǎn)。