粟 文,謝恩義,孫立偉,王艷平,王 惠,徐日升
( 廣東海洋大學 水產學院,廣東 湛江 524088 )
礁膜(Monostromanitidium)又名綠紫菜,屬綠藻門、石莼目、礁膜科、礁膜屬,是冬、春季大型海藻,為一層細胞組成的膜狀體,黏滑,基部細胞向下延伸出假根絲組成固著器,成熟時產生雌、雄配子,配子結合為合子,并生長發(fā)育成孢子體。孢子體小型,囊球狀,孢子囊成熟后可產生有4條鞭毛的游孢子[1]。研究發(fā)現(xiàn),礁膜營養(yǎng)豐富,含有較高的蛋白質、碳水化合物及多種維生素和礦質元素,口感好,食用價值高,并具有藥用價值,有清熱化痰、利水解毒、軟堅散結的作用,常用于治療喉炎、咳嗽痰結、水腫等[2-4];從中提取的硫酸多糖有抗凝血、抗氧化、降血脂和抗炎活性[5-6],因此,礁膜是一種極具開發(fā)潛力的海洋食品、藥物和化妝品等資源。雖然國內對綠藻的開發(fā)利用呈現(xiàn)上升的趨勢,浙江等地已形成了一定規(guī)模的綠藻加工產業(yè),但產量還遠遠不能滿足國內外的需求[7-8]。因此開展綠藻栽培種——礁膜的人工育苗技術的研究具有重要意義。
20世紀90年代,日本Kida[9]較早完成了礁膜的人工育苗與栽培技術,日本礁膜的產業(yè)化已經比較完善,栽培技術處于領先水平。隨后,國內陳昌生等[10-12]研究了生態(tài)因子對礁膜配子和合子的影響;Hua等[13]研究了寬礁膜(M.latissimum)的生活史;謝恩義等[14]對寬礁膜的基礎生物學及室內育苗與栽培進行了較全面的研究;李曉麗等[15]對北極礁膜(M.arcticum)進行了合子采苗、孢子囊培養(yǎng)和孢子采苗等人工育苗試驗。這些研究多側重于基礎研究,雖然有過人工育苗的嘗試,但均未達到規(guī)?;绲囊?。要發(fā)展我國礁膜栽培業(yè),首先需要建立室內人工育苗技術,筆者對廣東地區(qū)礁膜進行了配子放散、合子附著與培養(yǎng)等相關試驗,旨在建立一套我國礁膜室內人工大規(guī)模育苗技術。
礁膜種藻于2016年3月至4月下旬采自廣東湛江硇洲島附近海域的中高潮帶,藻體加冰低溫運輸帶回實驗室,用消毒海水(經砂濾及暗沉淀處理的自然海水煮沸消毒20 min,冷卻至常溫)清洗去除藻體表面的泥沙和雜藻。
挑選藻體顏色為黃褐色,鏡檢邊緣有一圈成熟配子囊的種藻,吸干藻體表面水分,取1 g種藻放入培養(yǎng)皿中加入20 mL消毒海水(鹽度27),置于有自然光的恒溫室內(24±0.5) ℃,連續(xù)觀察24 h,每隔2 h用移液槍取25 μL配子液移至載玻片上,根據(jù)蓋玻片與視野面積之比,求出蓋玻片下的視野數(shù)(即25 μL配子液的配子數(shù)量),從而計算出 20 mL中配子放散量。每次觀察后同時清洗藻體并更換消毒海水。
黑暗時間對合子附著的影響:設置8個直徑為6 cm培養(yǎng)皿,每個培養(yǎng)皿放入3塊2 cm×2 cm×1 mm PVC苗板,倒入相同量配子液,置于黑暗處連續(xù)培養(yǎng)16 h[12-13],每隔2 h取出1個培養(yǎng)皿,顯微鏡下(10×10)觀察合子附著數(shù),根據(jù)苗板面積與視野面積之比,計算出每塊苗板的合子附著總數(shù),取均值。
不同附著基對合子附著的影響:將PVC塑料板、PET塑料板、纖維板、普通玻璃板和有機玻璃板5種不同材料2 cm×2 cm×1 mm的苗板分別放入5個直徑為6 cm培養(yǎng)皿,每個培養(yǎng)皿3塊相同材料苗板,置于黑暗處12 h后同上計算苗板合子附著總數(shù)。
用內徑0.48 cm的鉆孔器取硅藻附著基本一致的苗板圓片,放入200 mL消毒海水中,二氧化鍺質量濃度梯度設置為0、0.1、0.3、0.5、1、3、5、10、20、30、40 mg/L。顯微鏡下(10×10)觀察各圓片附著的硅藻數(shù),計算出二氧化鍺對附著硅藻處理后的脫落率或增長率。
配子放散:將清洗干凈的種藻均勻鋪于干凈通風處陰干10~16 h(種藻含水量50%~60%),稱量0.9 kg放入40 L消毒海水中(鹽度27、溫度24 ℃),充氣攪拌,用光照度為5×104~9×104lx的強光照射,約5 min后加入適量45 ℃蒸餾水[13],約30 min后用篩絹過濾出種藻即得配子液。同上計算配子放散總量。
合子附著與培養(yǎng):將200張PVC苗板浸入40 L配子液中,黑暗處理12 h,合子附于PVC苗板后(同上計算合子附著總數(shù))分置于4個塑料水槽中培養(yǎng),水容積180 L,每個月更換消毒海水1~2次。培養(yǎng)期間,每隔5 d測1次水溫、鹽度、光照和合子直徑,每次測量20個合子,取其平均值。
采集游孢子及培育:游孢子采苗使用的附著基為維尼綸繩(海區(qū)栽培多采用苗繩,直徑1 cm)。采游孢子時,將生長成熟孢子囊的PVC苗板移入消毒海水中,強光照射(5×104~9×104lx),經攪拌待大量游孢子放出,水色變?yōu)闇\綠色時,取出PVC苗板,放入維尼龍繩,浸泡、翻動,待游孢子附著后移至塑料水槽內培養(yǎng),水容積180 L。
數(shù)據(jù)采用Excel 2007和SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計分析,結果以平均值±標準差表示,取P<0.05為顯著差異,P<0.01為極顯著差異。
3月初即將成熟的礁膜,在室內適宜條件下暫養(yǎng)約4 d,藻體邊緣顏色由綠色變成黃褐色,配子囊迅速成熟。鏡檢可見在成熟的配子囊放散配子前,囊壁變成透明狀,極易吸水破裂,配子即從裂口噴射而出。8:00—12:00配子放散量較少,14:00配子放散量較多,18:00—2:00配子放散量基本不變,4:00和6:00出現(xiàn)一個放散小高峰期,且在4:00時候配子放散量最高(圖1)。礁膜24 h晝夜均能進行配子放散,因此室內規(guī)?;斯び鐣r可在較為方便的任何時間段進行采苗。
圖1 礁膜配子的日放散規(guī)律
黑暗時間對合子附著的影響見圖2。由圖2可知,黑暗2~16 h均有合子附著,但黑暗時間短(2~6 h),合子附著密度低;隨著黑暗時間的延長合子附著密度迅速增加,黑暗第8 h,合子的附著數(shù)達到最高,為8.7×105個。黑暗時間繼續(xù)延長,合子附著數(shù)逐漸下降,到第14 h時苗板合子附著數(shù)僅約為第8 h的65%。t檢驗表明,黑暗8~12 h間合子附著數(shù)無顯著差異(P>0.05)。
圖2 黑暗時間對合子附著的影響
不同材料的苗板對合子附著的影響見圖3。由圖3可知,黑暗處理12 h,合子均能很好地附著于5種材料苗板上,合子附著數(shù)為3.4×105~3.8×105個。t檢驗表明,5種材料苗板之間的合子附著數(shù)不存在顯著差異(P>0.05)。
圖3 不同材料的苗板對合子附著的影響
二氧化鍺清除硅藻的效果見表1。隨著二氧化鍺質量濃度的增加和處理時間的延長,硅藻脫落呈現(xiàn)遞增趨勢。當二氧化鍺質量濃度大于0.5 mg/L時,對附生硅藻的脫落作用顯著;當二氧化鍺質量濃度達3 mg/L時,苗板圓片上附生的硅藻在第11 d全部脫落。處理后的苗板圓片移至消毒海水繼續(xù)培養(yǎng)20 d,鏡檢合子正常生長。
配子放散時可觀察到大量配子聚集在一起成云霧狀,海水變?yōu)闇\綠色,配子放散總數(shù)達4×1010個,平均每克藻體放散配子量高達4.4×108個。合子的培養(yǎng)條件及生長見表2。礁膜合子培養(yǎng)時間自4月中旬至9月中旬,歷時約5個月。合子培養(yǎng)前期(4—6月),水溫較低,生長較快,合子由5.2 μm增至39 μm,6月下旬,鏡檢合子內形成顆粒狀的游孢子,轉為孢子囊。7—8月水溫較高,孢子囊生長緩慢,9月上旬進行遮光處理,以促使孢子囊同步成熟。附著于維尼綸繩上的游孢子,培育15 d后可生長至長度為1 cm的礁膜幼苗。
表1 二氧化鍺去除硅藻的效果
表2 合子的培養(yǎng)條件及生長
礁膜室內人工育苗技術能有效解決大面積推廣所需礁膜種藻的問題,緩解種質退化,為礁膜的規(guī)?;斯び缂霸耘嗵峁┘夹g支撐。根據(jù)多次采集種藻進行配子放散試驗發(fā)現(xiàn),在礁膜繁殖盛期3月下旬至4月下旬期間的大潮前后可采集到成熟度較好的種藻,用于生產性育苗。根據(jù)礁膜屬已有的人工育苗研究[13-15]以及試驗可知,對種藻進行室內陰干刺激處理10~16 h,在采配子過程中充氣攪拌、強光照射、改變海水溫度(±2~3 ℃為宜)和鹽度(±3~5為宜)能一定程度促使配子集中大量放散。
Kida[9]將附著板打孔穿繩后,采用懸掛式方法進行合子附著和培養(yǎng)。本試驗采用插槽式方法進行合子附著和培養(yǎng),能極大提高育苗效率,且便于操作管理。規(guī)?;斯び缃ㄗh選用經砂輪打磨過的PVC塑料板作為苗板,便于在5個月的合子、孢子囊培養(yǎng)期里在顯微鏡下隨時觀察記錄其生長情況,苗板不宜過大,建議規(guī)格為20 cm×10 cm×1 mm。礁膜配子具趨光性,進行合子附著黑暗處理能使合子較均勻附著于苗板上,且能增加配子結合成合子的幾率[16],但初生合子抗逆性弱,長久得不到光照,生長會受抑制,甚至死亡。本研究采用PVC苗板作為附著基,黑暗8~12 h時合子附著效率最高,這與陳昌生[11]直接采用培養(yǎng)皿為附著基黑暗10 h合子附著率達到最大的試驗結果相接近。合子在轉為孢子囊前光照度不能長期低于900 lx,超過2~3 d合子會迅速死亡。培養(yǎng)過程中苗板上極易滋長藍藻、綠藻和硅藻等雜藻,雜藻大量生長,搶占、替代合子生態(tài)位點,或釋放孢子萌發(fā)成小苗而覆蓋合子[13],進而導致合子死亡。用0.5~3 mg/L二氧化鍺處理11 d能有效去除合子培養(yǎng)過程中滋生的硅藻,藍藻和綠藻可采用干燥的方法抑制其著生,但無法徹底根除,且繁殖速度極快。合子、孢子囊的培養(yǎng)期有5個月,培育效果直接影響到礁膜人工育苗的成敗,因此亟待進一步從根本上解決雜藻生長引起的合子死亡的問題。
圖4 礁膜室內人工育苗a.種藻室內陰干10~16 h;b.種藻放入消毒過濾海水中,采用充氣攪拌、強光照射等方法促進配子放散;c.將種藻濾出后的配子液;d.將PVC苗板浸入配子液中;e.黑暗處理8~12 h,使雌、雄配子結合成合子附著于PVC苗板上;f.附有合子的PVC苗板;g.附于PVC苗板上的合子(10×10);h.室內合子培養(yǎng);i.孢子囊釋放游孢子(10×10);j.培育15 d長度為1 cm的礁膜幼苗(4×10).