孫小惠，薛 衡，洪 惠，李 燕，羅永康*

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083）

鯉魚（Cyprinus carpio）原產(chǎn)亞洲，是淡水魚類中分布最廣、養(yǎng)殖歷史最悠久的溫帶淡水經(jīng)濟魚類[1]。鯉魚肉質(zhì)細嫩、營養(yǎng)豐富、蛋白質(zhì)含量高，脂肪多以不飽和脂肪酸為主，易被人體消化吸收[2]，并且能給人體提供必需的氨基酸、維生素等營養(yǎng)成分[3]。但魚肉由于水分含量高、組織細嫩、蛋白水解酶活性較強，易發(fā)生腐敗變質(zhì)[4]。因此，探究水產(chǎn)品有效的貯藏保鮮方法對降低損失、提高經(jīng)濟效益、促進水產(chǎn)品行業(yè)的生產(chǎn)發(fā)展至關(guān)重要[5]。

目前，水產(chǎn)品的貯藏保鮮方法主要有氣調(diào)保鮮、低溫保鮮及化學(xué)保鮮等[6]。近年來，各類天然保鮮劑逐漸成為水產(chǎn)保鮮行業(yè)的研究熱點。殼聚糖是α-氨基-D-葡胺糖通過β-1,4-糖苷鍵連接形成的直鏈狀多糖，可以通過甲殼素脫乙酰制得[7]，具有抗菌性、成膜性及無毒無害等多種優(yōu)良特性[8]。殼聚糖容易在物體表面形成對O2、CO2、C2H4具有一定選擇滲透作用的半透膜，可以有效減少微生物的污染[9]。由于殼聚糖具有多種優(yōu)點，已經(jīng)逐漸成為天然食品添加劑領(lǐng)域研究的熱點材料[10]。

Hassanzadeh等[11]研究含葡萄籽提取物（grape seed extract，GSE）的殼聚糖食用涂料對冷藏虹鱒魚（Oncorhynchus mykiss）片貨架期的影響，指出經(jīng)2%殼聚糖涂膜的虹鱒魚塊的硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）值、過氧化值（peroxide value，POV）和pH值均低于對照組魚片，并且加入0.1% GSE的殼聚糖涂膜具有更好的效果，在抑制需氧嗜溫和嗜冷細菌方面效果顯著，可以幫助維持感官質(zhì)量并延長虹鱒魚片在冷藏條件下的貨架期。Gómez-Estaca等[12]研究殼聚糖與丁香精油結(jié)合對鱈魚（Pollachius pollachius）的保鮮效果，結(jié)果表明，殼聚糖與丁香精油結(jié)合處理能夠顯著抑制革蘭氏陰性桿菌的生長，特別是有效抑制腸桿菌的增長。Li Tingting等[13]研究茶多酚、迷迭香提取物與殼聚糖相結(jié)合對4 ℃冷藏大黃魚（Pseudosciaena crocea）的保鮮效果，結(jié)果表明，0.2%茶多酚和0.2%迷迭香浸漬處理后與殼聚糖包衣相結(jié)合可以有效保持魚片的品質(zhì)，并且與對照組相比，保質(zhì)期延長8～10 d。Mohan等[14]研究食用殼聚糖涂層（1%和2%）對冰凍印度油沙丁魚（Sardinella longiceps）品質(zhì)的影響，結(jié)果表明，殼聚糖食用涂層可以有效抑制細菌生長，顯著減少揮發(fā)性堿和氧化產(chǎn)物的形成，并且提高魚肉的持水能力。

目前，殼聚糖對冷藏鯉魚片品質(zhì)影響方面的研究較少，且殼聚糖不溶于水，能溶于稀酸，大多數(shù)研究均采用醋酸溶解殼聚糖形成的溶液來處理魚片。醋酸本身具有一定的防腐和抑菌效果，因此無法判斷在此過程中殼聚糖自身所發(fā)揮的效應(yīng)。因此本研究以鯉魚為研究對象，通過測定4 ℃冷藏條件下對照組、20 g/L殼聚糖+0.5%醋酸組以及0.5%醋酸組鯉魚片的感官分值、菌落總數(shù)（total aerobic counts，TAC）、生物胺含量、揮發(fā)性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量及pH值等指標(biāo)，探討殼聚糖對鯉魚片品質(zhì)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

25 條鯉魚購于北京北醫(yī)三院農(nóng)貿(mào)市場，平均體質(zhì)量（0.98±0.03） kg，平均體長（37.00±1.00） cm；殼聚糖購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司，其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

KDY-9820半自動凱式定氮儀 北京通潤源機電儀器設(shè)備公司；DHP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；BCD-251WBCY冰箱 青島海爾股份有限公司；YT-C1-1ND超凈工作臺 北京亞泰科隆實驗科技開發(fā)中心；FW2000高剪切分散乳化機 上海弗魯克流體機械制造有限公司；LC-10AT series高效液相色譜儀 日本島津公司；FE20 pH計 瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 鯉魚預(yù)處理

鮮活鯉魚運到實驗室后，立即宰殺、去鱗、去頭、去內(nèi)臟，清洗內(nèi)部及體表，每條魚取兩側(cè)魚片，單條鯉魚耗時約5 min。使用自來水將魚片表面清洗干凈并瀝干，將魚片分為3 組。對照組置于聚乙烯保鮮袋中，于4 ℃冰箱中貯藏；T1組用20 g/L殼聚糖+體積分數(shù)0.5%醋酸水溶液浸泡1 min后置于聚乙烯保鮮袋中，于4 ℃冰箱中貯藏；T2組用體積分數(shù)0.5%醋酸水溶液浸泡1 min后置于聚乙烯保鮮袋中，于4 ℃冰箱中貯藏。每隔2 d每組隨機取3 塊魚片進行TAC、TVB-N含量、生物胺含量、感官分值和pH值的測定。

實驗前對不同體積分數(shù)醋酸溶解的殼聚糖溶液進行可接受性測試，最終選擇0.5%作為醋酸的最終體積分數(shù)。

1.3.2 感官分值測定

參照周忠云等[15]的方法。由經(jīng)過培訓(xùn)的8 名實驗室成員組成感官評價小組，根據(jù)表1所示的鯉魚感官評分標(biāo)準(zhǔn)進行打分。各項目指標(biāo)分5 級，最高分為5 分，最低分為1 分，總分為20 分。將4 個項目的總分計為該魚塊的綜合得分，感官分值低于12 分認為無法食用。

1.3.3 TVB-N含量測定

參照Hong Hui等[16]的方法，并稍作修改。取5.00 g絞碎的魚肉，加入50 mL蒸餾水，均質(zhì)25 s后置于搖床上振搖30 min，離心3 min（3 600 r/min）；取5 mL離心管中的上清液和5 mL氧化鎂懸濁液（10 g/L）于消化管中混合后進行蒸餾，向10 mL硼酸溶液（20 g/L）中加入50 μL甲基紅-次甲基藍指示劑（2 g/L）作為吸收液，蒸餾5 min；用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.01 mol/L）進行滴定，根據(jù)消耗的鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液體積計算TVB-N含量，滴定終點為藍紫色。

1.3.4 pH值測定

參照汪之穎等[17]的方法，使用pH計進行測定。

1.3.5 TAC測定

參照胡素梅等[18]的方法，并稍作修改。在超凈工作臺中稱取5.00 g魚肉，放入拍打袋內(nèi)，向其中加入45 mL無菌生理鹽水，放入拍打式均質(zhì)機拍打15 s，制成質(zhì)量濃度為10 g/mL的樣品稀釋液；用4.5 mL的無菌生理鹽水進行梯度稀釋。選擇2～3 個合適的稀釋度，用平板涂布法進行測定。培養(yǎng)條件：（30±1） ℃，72 h。

1.3.6 生物胺含量測定

參照Shi Ce等[19]的方法，并稍作修改。取5.00 g絞碎的魚肉，加入10 mL 0.6 mol/L、4 ℃的高氯酸溶液，勻漿20 s，4 ℃條件下離心（10 000×g，5 min）后，取上清液，所得沉淀重復(fù)上述步驟，合并2 次離心所得上清液，用0.6 mol/L高氯酸溶液將其定容至25 mL。提取液保存在-20 ℃條件下待測。

生物胺的衍生：取0.2 mL生物胺提取液，依次加入40 μL 2 mol/L氫氧化鈉溶液、60 μL飽和碳酸氫鈉溶液和0.4 mL丹磺酰氯溶液（10 mg/mL，丙酮溶解），混合均勻后于40 ℃條件下避光反應(yīng)45 min，殘余的丹磺酰氯用20 μL的濃氨水去除；室溫靜置30 min后，用乙腈調(diào)整體積至1 mL，最后用0.22 μm的有機相濾膜過濾。

液相色譜檢測條件：色譜柱為COSMOSIL 5C18-PAQ反相色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；進樣量50 μL；流動相A為0.1 mol/L乙酸銨溶液，流動相B為乙腈溶液；采用梯度洗脫方式，洗脫程序為：0 min，50%流動相B；25 min，90%流動相B；35 min，90%流動相B；45 min，50%流動相B；流動相流速0.8 mL/min；檢測波長254 nm。通過比較樣品和生物胺標(biāo)品的保留時間和峰面積進行定性及定量分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)均為3 個平行，采用Excel 2013進行數(shù)據(jù)處理，SPSS軟件進行單因素方差分析，各組數(shù)據(jù)之間的差異性用最小顯著性差異法在0.05的置信區(qū)間（P＜0.05）進行分析，實驗結(jié)果均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 殼聚糖對冷藏鯉魚片感官品質(zhì)的影響

圖1 鯉魚片貯藏期間的感官分值變化Fig.1 Changes in sensory scores of carp fillets during storage

由圖1可知，3 組鯉魚片的感官分值均隨著貯藏時間的延長而下降。貯藏前4 d，3 組鯉魚片的感官分值均緩慢下降，且無顯著性差異（P＞0.05）；貯藏4 d后，隨著貯藏時間的延長，對照組鯉魚片的感官分值下降最快，在貯藏第6、8、10天時的感官分值分別下降至13.32、11.33、7.24 分，貯藏8 d時已經(jīng)伴隨明顯的腐敗臭味，這與呂健等[20]對冷藏鳙魚片的研究結(jié)果相似。T1、T2組鯉魚片的感官分值變化趨勢較為相似，但T2組鯉魚片的感官分值在貯藏期間低于T1組，這主要是由于T2組鯉魚片有輕微的酸味，魚肉體表泛白且彈性較差。貯藏8 d時T1、T2組鯉魚片的感官分值分別降至15.10和14.36，并在10 d后不可接受。與對照組相比，T1組鯉魚片的感官可接受時間延長了約2 d，這可能是由于殼聚糖和醋酸抑制了微生物的繁殖，從而延緩了鯉魚片感官品質(zhì)的劣變。

2.2 殼聚糖對冷藏鯉魚片TVB-N含量的影響

圖2 鯉魚片貯藏期間的TVB-N含量變化Fig.2 Changes in TVB-N content of carp fillets during storage

TVB-N是評價魚肉腐敗變質(zhì)的常用指標(biāo)，TVB-N含量越大說明肉類的腐敗程度越高[21]。由圖2可知，鯉魚片的初始TVB-N含量為5.32 mg/100 g。貯藏前6 d，各組鯉魚片的TVB-N含量平穩(wěn)上升，無顯著差異（P＞0.05），這是由于貯藏初期的TVB-N主要來源于腺嘌呤核苷酸在內(nèi)源酶作用下發(fā)生的脫氨反應(yīng)，此時魚肉中的微生物正處于被抑制生長的狀態(tài)，直至后期微生物進入對數(shù)生長期，代謝作用旺盛，才使TVB-N含量快速增加[22]。隨著貯藏時間的延長，對照組鯉魚片第8天時的TVB-N含量顯著升高（P＜0.05），在貯藏10 d時達到最大值31.37 mg/100 g，超過淡水魚TVB-N含量的二級鮮度標(biāo)準(zhǔn)（20 mg/100 g），與T1、T2組差異顯著（P＜0.05），這與Zhang Yuemei等[23]對鯉魚片的研究結(jié)果相類似。T1組鯉魚片的TVB-N含量在貯藏10 d時出現(xiàn)較為明顯的上升，達13.07 mg/100 g（＜20 mg/100 g）。T2組鯉魚片的TVB-N含量變化趨勢與T1組類似，在貯藏10 d時達15.96 mg/100 g。整個貯藏過程中，T1、T2組鯉魚片的TVB-N含量均未超過二級鮮度標(biāo)準(zhǔn)，并且T1組低于T2組。殼聚糖作為一種抗菌劑，能夠抑制部分微生物的生長繁殖，對微生物分解魚肉蛋白質(zhì)具有一定的抑制作用，同時可以抑制酶的活性，由此可以看出殼聚糖具有延緩腐敗的作用。

2.3 殼聚糖對冷藏鯉魚片pH值的影響

圖3 鯉魚片貯藏期間的pH值變化Fig.3 Changes in pH value of carp fillets during storage

由圖3可知，隨著貯藏時間的延長，3 組鯉魚片的pH值均先下降后上升。生鮮鯉魚片的pH值為6.84，對照組鯉魚片在貯藏第2天下降到最低值（6.47），T1、T2組在第4天下降至最低值，分別為6.48和6.59。貯藏初期，糖原酵解產(chǎn)生乳酸，ATP、磷酸肌酸等物質(zhì)分解產(chǎn)生磷酸等酸性化合物，使得魚肉的pH值逐漸降低，但隨著貯藏時間的延長，魚肉進入自溶腐敗階段，其中的蛋白質(zhì)在微生物的作用下發(fā)生分解，產(chǎn)生堿性物質(zhì)，使魚肉的pH值逐漸升高[24]。貯藏第10天，對照組鯉魚片的pH值升高至7.02，而T1組為6.72，顯著低于對照組（P＜0.05），并且低于T2組。醋酸的加入使魚片的pH值保持在較低的水平，同時，殼聚糖的加入能夠抑制鯉魚片中微生物的生長繁殖，延緩pH值的變化，改善魚肉品質(zhì)。

2.4 殼聚糖對冷藏鯉魚片TAC的影響

魚肉中的各類微生物是引起魚肉腐敗變質(zhì)的重要原因[25]。由圖4可知，對照組鯉魚片的初始菌落總數(shù)為3.49 （lg（CFU/g）），而T1、T2組鯉魚片的初始菌落總數(shù)分別為2.71、3.10 （lg（CFU/g）），這可能是由于醋酸及殼聚糖處理具有殺滅微生物的作用。3 組鯉魚片的TAC均隨著貯藏時間的延長顯著升高（P＜0.05）。貯藏前4 d，對照組鯉魚片的微生物生長速率顯著高于T1、T2組（P＜0.05），并在貯藏6 d時達到7.46 （lg（CFU/g）），超過微生物可接受標(biāo)準(zhǔn)（7.00 （lg（CFU/g）））[26]，這與王航等[27]的研究結(jié)果相似。T1組鯉魚片的TAC顯著低于對照組與T2組（P＜0.05），并在貯藏8 d時達到7.31 （lg（CFU/g）），表明殼聚糖具有一定的抑菌作用。T2組鯉魚片的TAC在貯藏前4 d顯著低于對照組（P＜0.05），但在4 d后迅速上升，并在6 d時達到7.41 （lg（CFU/g）），可以看出醋酸本身具有一定的抑菌效果，但殼聚糖結(jié)合醋酸的抑菌效果最好。

圖4 鯉魚片貯藏期間的TAC變化Fig.4 Changes in TAC of carp fillets during storage

2.5 殼聚糖對冷藏鯉魚片生物胺含量的影響

表2 鯉魚片貯藏期間的生物胺含量變化Table 2 Biogenic amine concentrations in carp fillets during storage mg/kg

由表2可知，所有樣品中，精胺是主要生物胺，其在被檢測的5 種生物胺（腐胺、尸胺、組胺、亞精胺和精胺）中含量最高，這與張月美等[28]的研究結(jié)果相似。腐胺、尸胺和組胺的含量通常用于確定魚肉的品質(zhì)和安全性，Marks等[29]的研究也指出，腐胺和尸胺可以更好地反映魚體的腐敗程度。

鯉魚片中組胺含量為0.46～2.20 mg/kg，遠低于規(guī)定的組胺最大限量值50 mg/kg[30]。在貯藏過程中，3 組鯉魚片的組胺含量均呈先升高后降低的趨勢，這可能是由于隨著腐敗程度的增大，微生物的增加利用了部分組胺，3 組樣品的組胺含量未見顯著差異（P＞0.05）。貯藏初期，3 組鯉魚片中的腐胺和尸胺含量均較低，但隨著貯藏時間的延長，腐胺和尸胺的含量顯著上升（P＜0.05）。新鮮鯉魚片的腐胺含量為0.27 mg/kg，在貯藏8 d后達到1.01 mg/100 g，而T1、T2組分別達0.48、0.65 mg/kg，均顯著低于對照組（P＜0.05）。貯藏第10天，對照組鯉魚片的腐胺含量達5.91 mg/100 g，T2組達1.26 mg/100 g，而T1組僅為0.60 mg/100 g，顯著低于對照組和T2組（P＜0.05）。對照組鯉魚片貯藏10 d時的尸胺含量為0.86 mg/100 g，顯著高于T1、T2組（P＜0.05），并且在貯藏末期，T1組鯉魚片的尸胺含量顯著低于T2組（P＜0.05）。腐胺含量在貯藏后期迅速上升，這可能是由于貯藏后期魚肉中的微生物大量生長繁殖并產(chǎn)生氨基酸脫羧酶，氨基酸脫羧基而形成[31]。T1組鯉魚片貯藏后期的腐胺、尸胺含量顯著低于對照組和T2組，這可能是由于殼聚糖抑制了能夠產(chǎn)氨基酸脫羧酶微生物的生長。

3 結(jié) 論

在4 ℃冷藏條件下，鯉魚片的感官分值隨著貯藏時間的延長不斷下降，TVB-N含量、TAC、腐胺和尸胺的含量呈現(xiàn)明顯上升趨勢；使用20 g/L殼聚糖+體積分數(shù)0.5%醋酸處理鯉魚片后發(fā)現(xiàn)，其能抑制鯉魚片中微生物的生長，延緩TVB-N、腐胺和尸胺含量的上升以及pH值的變化，降低魚片的腐敗速率，延緩鯉魚片感官品質(zhì)的下降。鯉魚片在4 ℃冷藏條件下的貨架期約為8 d，殼聚糖處理可將鯉魚片的貨架期延長2 d。