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(1.廣東海洋大學(xué)化學(xué)與環(huán)境學(xué)院,廣東湛江 524088; 2.廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院,廣東湛江 524088)

鱟是地球上古老的生物之一,4億多年來(lái)保持著最原始的樣貌,是當(dāng)之無(wú)愧的活化石[1-2]。鱟的含血量大,成年鱟每年大約可以提供600 mL血。1956年,Bang[3]發(fā)現(xiàn)細(xì)菌能夠使鱟血細(xì)胞發(fā)生凝集,隨后Levin等[4]從鱟血細(xì)胞里分離純化出能與內(nèi)毒素產(chǎn)生凝集反應(yīng)的活性成分,人們利用這些活性物質(zhì)制備出鱟試劑,創(chuàng)立了鱟試劑內(nèi)毒素檢測(cè)法,運(yùn)用于檢查病人是否被細(xì)菌感染,并在藥品檢驗(yàn)過(guò)程中,用來(lái)檢測(cè)放射性藥物﹑抗生素類(lèi)﹑疫苗類(lèi)等制劑純度[5-6]。而提取出內(nèi)容物的血細(xì)胞往往被忽略、被廢棄,成為研究空白。

據(jù)2017年國(guó)家統(tǒng)計(jì)局最新數(shù)據(jù),中國(guó)已經(jīng)處于老齡化社會(huì),60周歲及以上人口24090萬(wàn),占總?cè)丝诘?7.3%。由于老年人各種細(xì)胞器官組織的結(jié)構(gòu)與功能老化,抵抗力下降,發(fā)病率增加,而且一個(gè)老年病患者往往同時(shí)患多種疾病。隨著生活水平的提高,生活節(jié)奏的加快,我國(guó)老年人易患的疾病包括糖尿病[7]和阿爾茲海默病。來(lái)源于海洋動(dòng)物的血細(xì)胞蛋白還具有低抗原性、低過(guò)敏性等特性,明顯優(yōu)于陸生動(dòng)物的血細(xì)胞蛋白[8-9],是制作保健品的理想原料。為了合理開(kāi)發(fā)利用鱟血細(xì)胞蛋白(TTBCP)這種寶貴資源,滿足人們對(duì)肽制品的需求,本文對(duì)TTBCP進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)學(xué)評(píng)價(jià),測(cè)定其體外抗氧化活性和對(duì)α-葡萄糖苷酶、乙酰膽堿酯酶抑制活性,以期獲得有價(jià)值的研究數(shù)據(jù)證明TTBCP可以用于治療糖尿病和阿爾茲海默病。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鱟血細(xì)胞蛋白(TTBCP) 湛江博康海洋生物有限公司;α-葡萄糖苷酶(酶活:300000 U/g)、碘化硫代乙酰膽堿(AICI,純度>98%,批號(hào):C7H16INOS)、5,5′-二硫代雙-2-硝基苯甲酸(DTNB,純度>99%,批號(hào):C14H8N208S2) 上海金穗生物科技有限公司;乙酰膽堿酯酶(酶活:200 U/g) 上海索萊寶生物科技有限公司;胃蛋白酶(酶活:3800 U/g)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH,HPLC 98%)、對(duì)硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(pNPG,純度為99%,批號(hào):K26J8B39810) 上海源葉生物科技有限公司;總抗氧化試劑盒(FRAP法,批號(hào):20170908) 南京建成生物科技有限公司;鄰苯三酚(AR) 上海麥克林生化科技有限公司;鐵氰化鉀(AR) 天津大茂化學(xué)試劑廠;H2O2(AR) 天津科密歐化學(xué)試劑有限公司;三氯乙酸(AR,純度>99.0%,批號(hào):20151210) 廣東光花科技股份有限公司;Tris-HCl(純度≥99.0%,批號(hào):EZ1609D313) 塞國(guó)生物科技責(zé)任有限公司。

DNM-9606酶標(biāo)分析儀 無(wú)錫瑞美生物電子科技有限公司;SPH-100B恒溫培養(yǎng)搖床 上海世平實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;UV-5500紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司;TF-FD-1臺(tái)式冷凍干燥機(jī) 上海田楓實(shí)業(yè)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 TTBCP中氨基酸的測(cè)定 按照GB/T5009.124-2003食品中氨基酸的測(cè)定方法,由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)測(cè)試中心完成。

1.2.2 TTBCP的水解方法 TTBCP用胃蛋白酶進(jìn)行水解,在酶解溫度37 ℃﹑酶濃度3%﹑底物濃度4%、pH1.0～2.0條件下,恒溫振蕩水浴3 h后,3000 r/min離心10 min,取上層清液,冷凍干燥后備用[10]。

1.2.3 氨基酸評(píng)分(AAS)方法 根據(jù)FAO/WHO 1993年建議的每克氨基酸評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)模式進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)價(jià)值評(píng)定,該模式中,蘇氨酸、纈氨酸、蛋氨酸+胱氨酸、苯丙氨酸+酪氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴(lài)氨酸和色氨酸分別為:4.0、5.0、3.5、6.0、4.0、7.0、5.5和1.0 g/100 g。氨基酸評(píng)分按下式計(jì)算:

氨基酸評(píng)分(%)=實(shí)驗(yàn)蛋白氨基酸含量/(FAO/WHO)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)模式氨基酸含量×100

1.2.4 蛋白質(zhì)效率比(PER) 根據(jù)Alesmeyer等[10]提出的方程計(jì)算蛋白質(zhì)的效率比,方程如下:

PER1=-0.684+0.456HLeu-0.47HPro

式(1)

PER2=-0.468+0.454HLeu-0.105HTyr

式(2)

PER3=-1.816+0.435HMet+0.780HLeu+0.211HHis-0.944HTyr

式(3)

式中:HLeu為L(zhǎng)eu在蛋白中的質(zhì)量百分含量;HPro為Pro在蛋白中的百分含量;HTyr為T(mén)yr在蛋白中的質(zhì)量百分含量;HMet為Met在蛋白中的質(zhì)量百分含量;HHis為His在蛋白中的質(zhì)量百分含量。

式中:A空白對(duì)照為PBS液+酶液的吸光度;A樣品組為樣品溶液+酶液的吸光度;A樣品對(duì)照組為樣品溶液+PBS液的吸光度。

1.2.6 對(duì)乙酰膽堿酯酶的抑制作用 根據(jù)改進(jìn)的Ellman[12]法,依次加入10 μL的0.6 U/mL乙酰膽堿酯酶液,20 μL不同濃度(濃度分別為0.04、0.08、0.12、0.16、0.20 mg/mL)的TTBCP水解液,10 μL 10.0 mmol/L的DTNB和50 μL 0.01 mol/L pH為7的PBS溶液于96孔板中,在37 ℃恒溫振蕩器中孵化2 min,然后加入10 μL 7.5 mmol/L 的AICI,繼續(xù)在37 ℃的環(huán)境下孵化30 min后測(cè)定A415。石杉?jí)A甲作為陽(yáng)性對(duì)照物,其濃度分別為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 μg/mL。

式中:A空白對(duì)照為PBS液+酶液的吸光度;A樣品組為樣品溶液+酶液的吸光度;A樣品對(duì)照組為樣品溶液+PBS液的吸光度

1.2.7 總抗氧化能力的測(cè)定 20 μL TTBCP水解液(濃度分別為0.04、0.08、0.12、0.16、0.20 mg/mL)加入180 μL FRAP工作液混勻,37 ℃恒溫振蕩器中孵化10 min后測(cè)定A593,根據(jù)反應(yīng)后吸光度,計(jì)算相應(yīng)FRAP值[13]。用維生素C作為陽(yáng)性對(duì)照物,其濃度分別為4.0、8.0、12.0、16.0、20.0 μg/mL。

式中:空白對(duì)照管以純水代替待測(cè)樣品;樣品對(duì)照管以無(wú)水乙醇代替DPPH無(wú)水乙醇溶液。

式中:空白對(duì)照管以純水代替待測(cè)樣品;樣品對(duì)照管以純水代替過(guò)氧化氫溶液。

式中:空白對(duì)照管以純水代替待測(cè)樣品;樣品對(duì)照管以純水代替鄰苯三酚溶液。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 TTBCP的氨基酸組成分析

TTBCP的氨基酸組成見(jiàn)表1。從表1可以看出,TTBCP中氨基酸組成全面,其中必需氨基酸模式優(yōu)于成人的FAO/WHO推薦模式,基本符合小孩FAO/WHO推薦模式(只有亮氨酸含量低于模式值)[17]。谷氨酸的含量最高(10.06 g/100 g),賴(lài)氨酸含量(5.81 g/100 g)略高于大豆蛋白(5.5 g/100 g)和大米蛋白(4.0 g/100 g)[18],組氨酸的含量(2.97 g/100 g)高于FAO/WHO模式(1.9 g/100 g)和雞蛋模式(2.2 g/100 g)[19]。TTBCP中甲硫氨酸和胱氨酸含量較高,表明鱟血中含有豐富的含硫氨基酸,含硫氨基酸可通過(guò)自身的抗氧化作用以及合成有重要抗氧化作用的谷胱甘肽來(lái)維持機(jī)體的氧化還原狀態(tài)平衡[20];谷氨酸在人體主要是以谷氨酰胺的形式存在,是細(xì)胞增殖生長(zhǎng)必不可少的物質(zhì),能夠?yàn)猷堰屎袜奏さ暮铣商峁┏渥愕牡碵21];賴(lài)氨酸促進(jìn)人體發(fā)育、增強(qiáng)免疫功能,并有提高中樞神經(jīng)組織功能的作用,充足的賴(lài)氨酸攝入是幼兒生長(zhǎng)發(fā)育的重要保障;組氨酸是幼兒的必需氨基酸,它能促進(jìn)幼兒的免疫系統(tǒng)盡早完善以及強(qiáng)化生理代謝等[19]。通過(guò)氨基酸組成分析可以看出,TTBCP是一種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高的蛋白。

表1 TTBCP的氨基酸組成Table 1 The amino acid composition of TTBCP

氨基酸根據(jù)化學(xué)成分的不同分為4類(lèi)，即非極性氨基酸、極性中性氨基酸、酸性氨基酸和堿性氨基酸。TTBCP的氨基酸分類(lèi)見(jiàn)表2,從表2可以看出,非極性氨基酸占TTBCP的24.61%,含量最高,酸性氨基酸次之,芳香族氨基酸含量最低,為7.87%。盡管芳香氨基酸含量最低,但仍略高于其在脫脂小麥胚芽(7.6 g/100 g)[22]中的含量。研究表明,非極性氨基酸和芳香氨基酸對(duì)多肽的生物活性有重要影響。當(dāng)非極性氨基酸和芳香族氨基酸出現(xiàn)在多肽的C端時(shí),該多肽具有較強(qiáng)的體外抗氧化活性[23-24]。因此,TTBCP可以用于制備生物活性肽。

2.2 TTBCP的營(yíng)養(yǎng)學(xué)評(píng)價(jià)

蛋白質(zhì)中的氨基酸含量特別是必需氨基酸含量是蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)學(xué)評(píng)價(jià)的重要指標(biāo),WHO/UN(1993)建議,高質(zhì)量的蛋白質(zhì)其必需氨基酸與總氨基酸的比值(E/T)在36%以上,合理的比值有利于氨基酸的利用,促進(jìn)蛋白質(zhì)代謝。從TTBCP的營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)表3可以看出,TTBCP的E/T為31.2%,略低于WHO/UN的(E/T)在36%以上理想模式,表明TTBCP中的氨基酸的利用率不太高。

表3 TTBCP的營(yíng)養(yǎng)學(xué)評(píng)價(jià)Table 3 Nutritional evaluation of TTBCP

TTBCP的第一限制性氨基酸是亮氨酸,第二限制性氨基酸是異亮氨酸,第三限制性氨基酸是纈氨酸,除了欠佳的亮氨酸,其他必需氨基酸含量均高于WHO/FAO的小孩建議模式,所以TTBCP主要是限制性必需氨基酸含量的不平衡,就單種必需氨基酸(除了亮氨酸)的含量來(lái)說(shuō)是達(dá)到人體需求量。

PER常作為蛋白質(zhì)吸收利用的評(píng)價(jià)指標(biāo),PER越大其吸收利用越高,當(dāng)?shù)鞍椎腜ER大于2.0時(shí),表明該蛋白有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[10],TTBCP效率比PER1、PER2和PER3小于2.0,進(jìn)一步顯示其中氨基酸的吸收利用率偏低,生物效價(jià)不高。如果補(bǔ)充第一限制性氨基酸亮氨酸含量,平衡TTBCP中各種氨基酸比例,最終將會(huì)改善氨基酸利用率,極大提高TTBCP的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

2.3 TTBCP水解肽對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用

圖1顯示TTBCP水解肽對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性呈現(xiàn)劑量依賴(lài)效應(yīng),隨著水解肽濃度的增加抑制率逐漸增強(qiáng),當(dāng)水解肽濃度為0.8 mg/mL時(shí),抑制率最強(qiáng)達(dá)到83.8%,其IC50值為0.199 mg/mL,約為陽(yáng)性對(duì)照阿卡波糖(IC50值為0.024 mg/mL)的十分之一,表明水解肽對(duì)α-葡萄糖苷酶有較好的抑制活性,按照α-葡萄糖苷酶的抑制劑的作用機(jī)理,水解肽通過(guò)口服經(jīng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白運(yùn)輸?shù)叫∧c,通過(guò)與多糖等碳水化合物競(jìng)爭(zhēng)的方式進(jìn)而抑制α-葡萄糖苷酶的活性,延緩和阻礙多糖等碳水化合物的消化分解成葡萄糖,最終減少對(duì)葡萄糖的吸收[25],達(dá)到降血糖、治療糖尿病的作用。

圖1 TTBCP水解肽對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制能力Fig.1 Inhibition ability of TTBCP hydrolysate on α-glucosidase

2.4 TTBCP水解肽對(duì)乙酰膽堿酯酶的抑制作用

由圖2可知,在所設(shè)定的水解肽濃度范圍內(nèi),隨著濃度的增加,其對(duì)乙酰膽堿酯酶的抑制能力也逐漸增強(qiáng),呈現(xiàn)正向量效關(guān)系,表明水解肽能抑制乙酰膽堿酯酶的活性,但是抑制率不超過(guò)38%,不到石杉?jí)A甲抑制率的一半,不適合開(kāi)發(fā)成阿爾茲海默病藥物。

圖2 TTBCP水解肽對(duì)乙酰膽堿酯酶的抑制能力Fig.2 Inhibition ability of TTBCP hydrolysate on acetylcholinesterase

2.5 TTBCP水解肽的抗氧化性分析

2.5.1 水解肽的總抗氧化能力分析 水解肽總抗氧化見(jiàn)圖3,由圖3可知,水解肽總抗氧化的FRAP值隨著水解肽質(zhì)量濃度的增大而減少,遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于維生素C的FRAP值。

圖3 TTBCP水解肽的總抗氧化能力Fig.3 Total antioxidative capacity of TTBCP hydrolysate

2.5.2 水解肽對(duì)DPPH自由基清除能力的影響 水解肽對(duì)DPPH自由基的清除能力如圖4所示,結(jié)果表明,隨著濃度的增加,水解肽對(duì)DPPH自由基的清除率增加,呈現(xiàn)劑量依賴(lài)關(guān)系,當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到最大值(0.80 mg/mL)時(shí),對(duì)DPPH自由基的清除能力也到達(dá)最大值,但不到維生素C清除率的一半。

圖4 TTBCP水解肽對(duì)DPPH自由基的清除能力Fig.4 Scavenging ability of TTBCP hydrolysate against DPPH free radicals

2.5.3 水解肽對(duì)羥自由基清除能力影響 水解肽對(duì)羥自由基的清除能力如圖5所示,水解肽在0.04～0.12 mg/mL濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)劑量依賴(lài)效應(yīng),隨著質(zhì)量濃度增大而增強(qiáng),水解肽濃度在0.12 mg/mL時(shí)清除率達(dá)到最大值,接近維生素C的清除率。在0.12～0.20 mg/mL時(shí)清除率有所下降,但仍有較高的清除率。

圖5 TTBCP水解肽對(duì)羥自由基的清除能力 Fig.5 Scavenging ability of TTBCP hydrolysate against hydroxyl free radicals

2.5.4 水解肽對(duì)超氧陰離子自由基清除能力影響 水解肽對(duì)超氧陰離子的清除能力如圖6所示,較低濃度下,水解肽表現(xiàn)出較好的清除能力,而當(dāng)濃度增加時(shí),清除能力并沒(méi)有隨著增加。因此,在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)清除率變化不大,采用最低濃度便能獲得和最高濃度相當(dāng)?shù)那宄省?/p>

圖6 TTBCP水解肽對(duì)超氧陰離子的清除能力Fig.6 Scavenging ability of TTBCP hydrolysate

2.5.5 水解肽的體外總還原能力分析 水解肽的還原能力如圖7所示。結(jié)果表明在0.4 mg/mL時(shí)還原能力最強(qiáng),隨著濃度增加,還原能力沒(méi)有變化,可以確定0.4 mg/mL為最佳使用濃度,在低于0.75 mg/mL濃度時(shí)還原能力均比維生素C高。

圖7 TTBCP水解肽的還原能力Fig.7 Reducing power of TTBCP hydrolysate

TTBCP水解肽對(duì)α-葡萄糖苷酶的半數(shù)抑制濃度(IC50)為0.199 mg/mL,抑制率最高達(dá)到83.8%,可以產(chǎn)生降血糖效果;因糖尿病以及糖尿病引起的并發(fā)癥都是跟“氧化應(yīng)激”有著密切的關(guān)系,氧化應(yīng)激導(dǎo)致胰島細(xì)胞受損﹑肝臟胰島素抵抗和外周胰島素抵抗[26],保持體內(nèi)氧化和抗氧化系統(tǒng)平衡至關(guān)重要,特別是中老年糖尿病人容易出現(xiàn)多余的活性氧,有必要食補(bǔ)具有抗氧化活性的物質(zhì);另外,藥物阿卡波糖會(huì)延遲葡萄糖在腸道的吸收[27],糖尿病人吃藥過(guò)程中需要補(bǔ)充一定的蛋白質(zhì)增強(qiáng)體能,具有清除超氧陰離子自由基﹑DPPH自由基和羥自由基,甚至當(dāng)濃度小于0.75 mg/mL的范圍時(shí),還原能力大于維生素C的TTBCP是不錯(cuò)的選擇。

3 結(jié)論

TTBCP中必需氨基酸優(yōu)于成人的FAO/WHO推薦模式,AAS為68.1,是有營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的蛋白質(zhì),由于其中亮氨酸所占比例略低,PER小于2.0,影響到TTBCP吸收利用,在食用TTBCP時(shí)要適當(dāng)補(bǔ)充亮氨酸。TTBCP對(duì)α-葡萄糖苷酶的半數(shù)抑制濃度(IC50)為0.199 mg/mL,抑制率高達(dá)83.8%,有望開(kāi)發(fā)成降血糖藥物;TTBCP能清除超氧陰離子自由基﹑DPPH自由基和羥自由基,當(dāng)濃度小于0.75 mg/mL的范圍時(shí),還原能力大于維生素C,具有較好的抗氧化活性,能減少氧化應(yīng)激,有助于糖尿病治療。由此可見(jiàn),TTBCP具有復(fù)合功效,對(duì)糖尿病人來(lái)說(shuō)既可提供營(yíng)養(yǎng)的優(yōu)質(zhì)蛋白,又可作為保健食品和降血糖藥物。