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(1.南昌大學(xué)食品學(xué)院,江西南昌 330047; 2.南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江西南昌 330047; 3.南昌大學(xué)，中德聯(lián)合研究院,江西南昌 330047)

赭曲霉毒素(ochratoxin)是由曲霉菌屬(Aspergillus)和青霉菌屬(Penicillium)的某些種產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物,包含7種結(jié)構(gòu)類似的化合物[1-2]。其中赭曲霉毒素A(ochratoxin A,OTA)毒性最強(qiáng),具有腎臟毒性、肝臟毒性及致畸、致癌和致突變等特性[3-4]。霍亂毒素B亞基(B subunit of Cholera toxin,CTB)通過最近鄰相互作用形成自組裝五元環(huán)狀結(jié)構(gòu)[5],通常被作為免疫佐劑,將抗原與其融合表達(dá)來提高免疫原性[6]。納米抗體(nanobody,Nb)又被稱為單域重鏈抗體(variable domain of heavy chain of heavy-chain)[7],由天然缺失輕鏈的重鏈可變區(qū)構(gòu)成,是自然存在的可與抗原結(jié)合的最小片段[8],具有分子質(zhì)量小、易改造、易于表達(dá)以及穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)[9-12]。納米抗體現(xiàn)已被廣泛的應(yīng)用于醫(yī)學(xué)診斷、藥物開發(fā)、食品安全檢測(cè)等方面[13-15]。結(jié)合基因工程技術(shù)可得到不同形式的納米抗體,如多價(jià)納米抗體[16]、融合型納米抗體[17]、多特異性納米抗體[18]等均有報(bào)道,相比其他抗體,經(jīng)過改造攜帶特定結(jié)構(gòu)的納米抗體具有更加明顯的優(yōu)勢(shì)。在前期工作中,實(shí)驗(yàn)室已成功構(gòu)建出pET-CTB-VHH28原核表達(dá)載體。本研究主要將該重組載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行原核表達(dá),利用CTB自組裝形成五聚體結(jié)構(gòu)，從而將納米抗體VHH28多聚化。通過優(yōu)化表達(dá)條件從而得到可溶性的融合蛋白CTB-VHH28,并對(duì)其活性及穩(wěn)定性進(jìn)行初步分析,為后續(xù)建立檢測(cè)OTA方法提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

重組載體pET-CTB-VHH28、表達(dá)菌株EscherichiacoliBL21(DE3) 均由本實(shí)驗(yàn)室保存;人工抗原OTA-BSA 由本實(shí)驗(yàn)室制備;OTA 美國(guó)Sigma-Aldrich 公司;HisTrapTMHP預(yù)裝柱(1 mL)、兔抗 HIS[HRP]多克隆抗體 美國(guó)GE公司;異丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷(Isopropy-β-D-thiogalactoside,IPTG) 美國(guó)Thermo Fisher公司,三(羥甲基)氨基甲烷,3,3,5,5-四甲基聯(lián)苯胺(TMB) 上海阿拉丁生化科技股份有限公司;其他試劑與藥品 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

酶聯(lián)免疫分析儀(Multiscan FC)、低溫高速離心機(jī)(Multifuge X1R) 美國(guó)Thermo公司;Millipore超純水儀 美國(guó)Millipore公司;恒溫?fù)u床 上海智城公司;DYY-I III瓊脂糖凝膠電泳儀 北京六一儀器廠;JY92-IIDN超聲波細(xì)胞破碎儀 寧波新藝超聲設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 CTB-VHH28誘導(dǎo)條件的確定 通過將重組載體PET-CTB-VHH28轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)中,成功表達(dá)出OTA五價(jià)納米抗體,分子量大小約150 kDa。為了得到純度較高的五價(jià)納米抗體及提高蛋白的表達(dá)量,本研究對(duì)誘導(dǎo)劑用量、誘導(dǎo)溫度及誘導(dǎo)時(shí)間三個(gè)主要因素進(jìn)行了優(yōu)化。

1.2.1.1 誘導(dǎo)劑IPTG濃度的確定 將37 ℃、220 r/min培養(yǎng)12 h的含有質(zhì)粒pET-CTB-VHH28的E.coliBL21(DE3)菌液，按1%的接種量接種至LB液體培養(yǎng)基(含有終濃度為100 μg/mL Amp)中,37 ℃、220 r/min培養(yǎng)至菌液OD600=0.6～0.8,加入不同濃度的IPTG(終濃度分別為0.02、0.05、0.1、0.2、0.5 mmol/L),20 ℃、180 r/min誘導(dǎo)表達(dá)12 h,取樣10 μL,加入蛋白上樣緩沖液,95 ℃加熱變性10 min,進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。

1.2.1.2 誘導(dǎo)溫度的確定 將37 ℃、220 r/min培養(yǎng)12 h的含有質(zhì)粒PET-CTB-VHH28的E.coliBL21(DE3)菌液，按1%的接種量接種至LB液體培養(yǎng)基(含有終濃度為100 μg/mL Amp)中,37 ℃、220 r/min培養(yǎng)至菌液OD600=0.6～0.8,加入誘導(dǎo)劑IPTG(終濃度為0.05 mmol/L),分別在16、20、25 ℃下,180 r/min誘導(dǎo)表達(dá)12 h,取樣10 μL,加入蛋白上樣緩沖液,95 ℃加熱變性10 min,進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。

1.2.1.3 誘導(dǎo)時(shí)間的確定 將37 ℃、220 r/min培養(yǎng)12 h的含有質(zhì)粒pET-CTB-VHH28的E.coliBL21(DE3)菌液，按1%的接種量接種至LB液體培養(yǎng)基(含有終濃度為100 μg/mL Amp)中,37 ℃、220 r/min培養(yǎng)至菌液OD600=0.6～0.8,加入誘導(dǎo)劑IPTG(終濃度為0.05 mmol/L),16 ℃、180 r/min分別表達(dá)2、4、6、8、10、12 h,取樣10 μL,加入蛋白上樣緩沖液,95 ℃加熱變性10 min,進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。

1.2.2 納米抗體CTB-VHH28聚合情況的分析 將37 ℃、220 r/min培養(yǎng)12 h的含有質(zhì)粒pET-CTB-VHH28的E.coliBL21(DE3)菌液，按1%的接種量接種至LB液體培養(yǎng)基(含有終濃度為100 μg/mL Amp)中,37 ℃、220 r/min培養(yǎng)至菌液OD600=0.6～0.8,加入誘導(dǎo)劑IPTG(終濃度為0.05 mmol/L),16 ℃、180 r/min誘導(dǎo)表達(dá)10 h,收集菌體,磷酸緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)清洗菌體,離心收集菌體,重懸至PBS中,超聲破碎,收集上清,過Ni柱純化,分別用含有20、50、100 mmol/L咪唑的緩沖溶液依次清洗柱體,洗去雜蛋白,含有200 mmol/L咪唑的緩沖液將目的蛋白洗脫,收集洗脫的目的蛋白,用1×PBS 4 ℃透析,每隔8 h更換一次透析液,透析24 h,分別取透析后的樣品各10 μL,分別加入含有β-巰基乙醇的上樣緩沖液加熱變性和不含β-巰基乙醇的上樣緩沖液,SDS-PAGE電泳分析。

1.2.3 間接ELISA測(cè)定納米抗體CTB-VHH28效價(jià) 100 μL/孔人工抗原OTA-BSA(2 μg/mL)加入酶標(biāo)板4 ℃包被過夜,PBST洗板3次,300 μL/孔4%脫脂牛奶37 ℃封閉2 h,PBST洗板3次,100 μL/孔不同稀釋倍數(shù)(分別稀釋400、800、1600、3200、6400、12800倍)的納米抗體CTB-VHH28,37 ℃孵育1 h,PBST洗板3次,100 μL/孔HIS二抗,37 ℃孵育1 h,PBST洗板3次,100 μL/孔TMB顯色液37 ℃顯色8 min,50 μL/孔終止液終止反應(yīng),測(cè)定OD450。

1.2.4 CTB-VHH28間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 100 μL/孔人工抗原OTA-BSA(2 μg/mL)加入酶標(biāo)板4 ℃包被過夜,PBST洗板3次,300 μL/孔4%脫脂牛奶37 ℃封閉2 h,PBST洗板3次,50 μL/孔納米抗體CTB-VHH28和50 μL/孔不同濃度的OTA標(biāo)準(zhǔn)品(0、0.05、0.1、0.25、0.5、1、2.5、5、10、25 ng/mL),37 ℃孵育1 h,PBST洗板3次,100 μL/孔HIS二抗,37 ℃孵育1 h,PBST洗板3次,100 μL/孔TMB顯色液37 ℃顯色8 min,50 μL/孔終止液終止反應(yīng),測(cè)定OD450。以結(jié)合率(B/B0,%)=[(競(jìng)爭(zhēng)抗原孔OD450值-空白對(duì)照OD450值)/非競(jìng)爭(zhēng)抗原孔 OD450值]×100為縱坐標(biāo),使用邏輯斯蒂方程(y=A2+(A1-A2)/[1+(x/x0)^p)擬合繪制CTB-VHH28-ELISA競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線。

1.2.5 納米抗體CTB-VHH28特異性分析 分別配制工作濃度(0、0.05、0.1、0.25、0.5、1、2.5、5、10、25 ng/mL)的黃曲霉毒素B1(Aflatoxin B1,AFB1)、玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(Deoxynivalenol,DON)標(biāo)準(zhǔn)品代替OTA標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA繪制相應(yīng)的競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線,計(jì)算其 IC50及交叉反應(yīng)率(Cross Reactivity,CR)。CR(%)=[IC50(OTA)/IC50(AFB 1/ZEN/DON)]× 100。

1.2.6 納米抗體CTB-VHH28熱穩(wěn)定性分析 取純化透析后的CTB-VHH28分別在30、40、50、60、70、80、90 ℃下孵育10 min,迅速冰浴5 min,取樣10 μL,加入不含有β-巰基乙醇的上樣緩沖液,上樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳，分析溫度對(duì)CTB-VHH28結(jié)構(gòu)的影響。取純化透析后的CTB-VHH28分別在25、35、45、55、65、75、85、95 ℃下孵育10 min,采用間接ELISA分析不同溫度處理的CTB-VHH28抗原結(jié)合活性。取純化后CTB-VHH28分別置于35、55、75 ℃三種溫度下,分別作用10、20、30、40、50、60 min,以剩余活性(%)=(加熱處理的CTB-VHH28 OD450/未處理的CTB-VHH28 OD450)×100%為縱坐標(biāo),分析CTB-VHH28熱穩(wěn)定性。

1.2.7 甲醇濃度對(duì)納米抗體CTB-VHH28的影響 配制體積分?jǐn)?shù)為2.5%、5%、10%、20%、40%甲醇-PBS緩沖液稀釋OTA標(biāo)準(zhǔn)品至不同的工作濃度(0、0.05、0.1、0.25、0.5、1、2.5、5、10、25 ng/mL),納米抗體CTB-VHH28的工作濃度為0.06 μg/mL,間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA分析不同甲醇濃度對(duì)納米抗體CTB-VHH28的靈敏度的影響,繪制CTB-VHH28競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用Origin 8.0軟件,對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行非線性回歸分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 誘導(dǎo)劑IPTG濃度的確定

如圖1所示,誘導(dǎo)劑IPTG的濃度為0.02 mmol/L時(shí),CTB-VHH28蛋白的表達(dá)量最低,其他濃度IPTG對(duì)CTB-VHH28的表達(dá)量沒有明顯的影響。IPTG作為一種強(qiáng)誘導(dǎo)劑,在菌體中不能夠被代謝,可以持續(xù)地發(fā)揮作用,所以少量的IPTG就可以起到很好的誘導(dǎo)效果[19]。所以選擇終濃度為0.05 mmol/L的IPTG作為最佳的誘導(dǎo)劑濃度。

圖1 IPTG濃度對(duì)CTB-VHH28表達(dá)的影響Fig.1 Effect of IPTG concentration on the expression of CTB-VHH28注:M:廣譜蛋白Marker;1:未加入IPTG的菌體總蛋白; 2～6:IPTG濃度分別為0.02、0.05、0.1、0.2、 0.5 mmol/L誘導(dǎo)后的菌體總蛋白。

2.2 誘導(dǎo)溫度的確定

誘導(dǎo)溫度不僅影響菌體的生長(zhǎng),同樣影響著重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及蛋白的可溶性。很多蛋白在溫度較高條件下誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)容易出現(xiàn)錯(cuò)誤性折疊,從而形成包涵體沉淀,而低溫誘導(dǎo)可以有助于蛋白的可溶性表達(dá)及形成正確的結(jié)構(gòu)[20],如圖2所示,在16、20、25 ℃三種溫度下誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白量基本一致,故選取溫度更低的16 ℃為納米抗體CTB-VHH28最佳的誘導(dǎo)表達(dá)溫度,以實(shí)現(xiàn)可溶性表達(dá)及形成正確結(jié)構(gòu)。

圖2 誘導(dǎo)溫度對(duì)CTB-VHH28表達(dá)的影響Fig.2 Effect of induction temperature on the expression of CTB-VHH28注:M：廣譜蛋白Marker;1：誘導(dǎo)前菌體總蛋白; 2～4:分別在16、20、25 ℃下誘導(dǎo)后的菌體總蛋白。

2.3 誘導(dǎo)時(shí)間的確定

由圖3可知,納米抗體CTB-VHH28隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加,菌液中CTB-VHH28產(chǎn)量呈上升的趨勢(shì),當(dāng)誘導(dǎo)10 h后,CTB-VHH28表達(dá)量沒有明顯的變化,原因可能是隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加,菌體產(chǎn)酶逐漸飽和使其表達(dá)量不再增加,同時(shí)產(chǎn)生的外源蛋白也可能會(huì)被菌體產(chǎn)生的蛋白酶降解,使其表達(dá)量降低,故而選取10 h為納米抗體CTB-VHH28的最佳誘導(dǎo)時(shí)間。

圖3 誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)CTB-VHH28表達(dá)的影響Fig.3 Effect of induction time on the expression of CTB-VHH28注:M:廣譜蛋白Marker;1:誘導(dǎo)前菌體總蛋白;2～7:分別誘導(dǎo)表達(dá)2、4、6、8、10、12 h后的菌體總蛋白。

2.4 CTB-VHH28聚合情況分析

從圖4中可以得知,菌體破碎上清經(jīng)過Ni柱純化透析后，得到了較純的納米抗體且以五聚體的形式存在,分子量大約為150 kDa,而經(jīng)過加熱變性解鏈為單體后的分子量大小約為30 kDa,均與軟件(DNAstar)預(yù)測(cè)大小相一致。經(jīng)Nanodrop 1000定量計(jì)算得出重組蛋白表達(dá)量達(dá)20 mg/L。

圖4 CTB-VHH28聚合情況分析Fig.4 The result of CTB-VHH28 pentamer注:M:廣譜蛋白Marker;1:加入含有β-巰基乙醇的上樣Buffer且加熱變性的CTB-VHH28;2:加入不含有β-巰基乙醇上樣Buffer且不加熱的CTB-VHH28。

2.5 納米抗體CTB-VHH28的活性分析

間接ELISA測(cè)定納米抗體CTB-VHH28的效價(jià)。由表1可知,隨著納米抗體CTB-VHH28稀釋倍數(shù)的增加,OD450逐漸減小,說明因反應(yīng)體系中CTB-VHH28濃度降低,與人工抗原特異性結(jié)合的抗體減少,選取顯色值在1.0～1.2左右為最佳,當(dāng)稀釋6400倍(終濃度為:0.06 μg/mL)為最佳工作濃度。

表1 納米抗體CTB-VHH28效價(jià)測(cè)定Table 1 The test for potency of CTB-VHH28

間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA分析納米抗體CTB-VHH28活性,繪制CTB-VHH28-ELISA競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線。如圖5所示,當(dāng)反應(yīng)體系中OTA標(biāo)品濃度增加,OD450呈下降的趨勢(shì)。結(jié)果表明,納米抗體CTB-VHH28與人工抗原OTA-BSA的結(jié)合可被競(jìng)爭(zhēng)抗原OTA抑制且阻斷,顯示其出了良好特異性。在反應(yīng)體系甲醇濃度為2.5%時(shí),繪制CTB-VHH28-ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線,半數(shù)抑制率(IC50)為0.38 ng/mL。

圖5 間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA分析納米抗體CTB-VHH28活性Fig.5 Bioactivity analysis of CTB-VHH28 by indirect competitive ELISA注:A:納米抗體CTB-VHH28與OTA-BSA結(jié)合活性;B:CTB-VHH28間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.6 納米抗體CTB-VHH28特異性分析

如圖6所示,納米抗體CTB-VHH28與其他幾種真菌毒素幾乎無交叉反應(yīng),均小于1.5%,只與OTA特性結(jié)合,具有較高的特異性,可用于OTA的檢測(cè)。

圖6 CTB-VHH28與其他真菌毒素的交叉反應(yīng)率Fig.6 Cross reactivity of CTB-VHH28 with other mycotoxins

2.7 納米抗體CTB-VHH28熱穩(wěn)定性分析

通過SDS-PAGE初步分析五聚體結(jié)構(gòu)的熱穩(wěn)定性。如圖7所示,納米抗體CTB-VHH28在30～60 ℃處理5 min后,納米抗體的分子量均為150 kDa,五聚體結(jié)構(gòu)基本沒有被破壞,70 ℃處理5 min后,在30 kDa的位置逐漸出現(xiàn)條帶,且150 kDa的條帶變小,表明五聚體部分解鏈為單體。隨著溫度的升高,當(dāng)經(jīng)過90 ℃熱處理5 min后,納米抗體CTB-VHH28全部解鏈為30 kDa單體。納米抗體單體及霍亂毒素B亞基的肽鏈上均存在兩個(gè)半胱氨酸。肽鏈上的半胱氨酸殘基的巰基基團(tuán)能發(fā)生氧化反應(yīng)形成分子內(nèi)二硫鍵,當(dāng)加熱溫度過高時(shí)，二硫鍵被破壞,導(dǎo)致五聚體結(jié)構(gòu)被破壞為單體[21]。

圖7 溫度對(duì)CTB-VHH28五聚體結(jié)構(gòu)的影響Fig.7 Effect of temperature on the pentamer structure of CTB-VHH28注:M:高分子質(zhì)量蛋白Marker;1～7:分別在30、40、50、60、70、80、90 ℃加熱處理后的CTB-VHH28且加入不含β-巰基乙醇的上樣Buffer。

通過間接ELISA分析熱處理對(duì)CTB-VHH28活性的影響。如圖8(A)所示,CTB-VHH28在不高于65 ℃加熱10 min后,能保持75%以上活性,隨著溫度的升高，CTB-VHH28活性下降明顯,當(dāng)加熱溫度高于85 ℃時(shí),抗體基本失活。由圖8(B)可知,當(dāng)加熱溫度不高于55 ℃,CTB-VHH28結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,活性基本保持不變。綜合以上結(jié)果,可推斷CTB-VHH28失活的臨界溫度在55～75 ℃之間。

圖8 熱處理對(duì)納米抗體CTB-VHH28活性的影響Fig.8 Effect of heat treatment on activity of CTB-VHH28注:A:不同溫度處理對(duì)CTB-VHH28活性的影響; B:不同熱處理時(shí)間對(duì)CTB-VHH28活性的影響。

2.8 納米抗體CTB-VHH28的甲醇耐受性

OTA標(biāo)準(zhǔn)品難溶于水,易溶于有機(jī)溶劑,在ELISA試驗(yàn)中,OTA通常用甲醇-PBS溶解,而甲醇會(huì)影響抗體的構(gòu)象和抗原抗體的相互作用。如圖9所示,反應(yīng)體系中甲醇濃度為2.5%時(shí),CTB-VHH的IC50最低,可以達(dá)到0.38 ng/mL。反應(yīng)體系中甲醇濃度不高于10%時(shí),抗原與CTB-VHH28的結(jié)合能力沒有明顯變化。當(dāng)反應(yīng)體系中甲醇濃度為40%時(shí),CTB-VHH28與抗原的相互作用明顯減弱,競(jìng)爭(zhēng)抑制率下降。

圖9 CTB-VHH28甲醇耐受性分析Fig.9 Methanol tolerance analysis of CTB-VHH28

3 討論與結(jié)論

通常情況下,納米抗體從納米抗體庫中篩選得到,其表面有大量的親水殘基,保持嚴(yán)格的單體結(jié)構(gòu),即單價(jià)納米抗體。多價(jià)納米抗體是識(shí)別同一種表位的單價(jià)納米抗體的聚合物,其不僅具備單價(jià)納米抗體特性,且具有更多的抗原識(shí)別位點(diǎn)[22]?；魜y毒素B亞基(CTB)很容易分泌到胞外,用基因工程亦能得到高產(chǎn)量的CTB克隆株,即使在大腸桿菌宿主菌中,CTB仍能分泌在胞外或細(xì)胞周質(zhì)[23]。本研究基于重組載體pET25b-CTB-VHH28,將其轉(zhuǎn)入到大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行原核表達(dá),實(shí)現(xiàn)了OTA納米抗體VHH28與CTB融合蛋白的可溶表達(dá),并成功得到了五價(jià)的納米抗體CTB-VHH28。通過優(yōu)化納米抗體CTB-VHH28表達(dá)條件,確定了最佳表達(dá)溫度為16 ℃、誘導(dǎo)劑濃度為0.05 mmol/L、誘導(dǎo)時(shí)間為10 h。經(jīng)純化后得到了較純的五價(jià)納米抗體,大小為150 kDa。經(jīng)測(cè)定表達(dá)量可達(dá)20 mg/L,相較于納米抗體在E.coli中常見的表達(dá)量(10 mg/L)[24],該融合蛋白表達(dá)量較好。通過對(duì)CTB-VHH28分析,本研究制備的新型納米抗體CTB-VHH具有良好的特異性,與其他幾種常見的真菌毒素?zé)o交叉反應(yīng)。在反應(yīng)體系中,甲醇濃度為2.5%條件下,IC50為0.38 ng/mL。通過對(duì)納米抗體CTB-VHH28熱穩(wěn)定性及甲醇耐受性分析,當(dāng)加熱溫度高于85 ℃時(shí),抗體基本失活,CTB-VHH28失活的臨界溫度在55～75 ℃之間。反應(yīng)體系中甲醇濃度不高于10%時(shí),抗原與CTB-VHH28的結(jié)合能力沒有明顯變化。有利于提高檢測(cè)方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性,為建立OTA的檢測(cè)方法奠定了基礎(chǔ)。