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(1.運(yùn)城學(xué)院理科實(shí)驗(yàn)中心,山西運(yùn)城 044000; 2.運(yùn)城學(xué)院生命科學(xué)系,山西運(yùn)城 044000)

草莓(Strawberry)是薔薇科草本漿果類紅色水果,富含花色苷、VC、葉酸及酚類成分,具有抗氧化、抗癌及預(yù)防心血管疾病、消化不良等功效[1-2];柿子營(yíng)養(yǎng)豐富,含糖量高,具有潤(rùn)肺健脾、止咳化痰、生津止血、軟化血管等功效,但缺少葡萄、草莓等果實(shí)中所具有的構(gòu)成果酒品質(zhì)特性的有機(jī)酸[3-5]。草莓柿子復(fù)合果酒是以草莓和柿子為混合原料釀制成果酒,兼有草莓和柿子兩種水果的營(yíng)養(yǎng)和口感,彌補(bǔ)兩者的缺陷,使得果酒營(yíng)養(yǎng)全面,口感平衡,香氣濃郁[6-7]。

香味成分是評(píng)價(jià)果酒質(zhì)量的重要指標(biāo),決定果酒的風(fēng)格和典型性,直接影響消費(fèi)者對(duì)果酒的感官評(píng)價(jià)和喜好[8-9]。果酒的香味分為3類:一類來(lái)自果酒原料本身;二類主要由發(fā)酵過(guò)程中的微生物產(chǎn)生;三類主要由陳釀過(guò)程的一系列物理、化學(xué)及生物化學(xué)變化過(guò)程產(chǎn)生[10-12]。目前,關(guān)于復(fù)合果酒香氣成分的研究報(bào)道較少,莫海珍[13]等對(duì)柿子、山楂復(fù)合果酒的香氣物質(zhì)進(jìn)行了測(cè)定分析,馮莉梅等[14]對(duì)紫薯、獼猴桃復(fù)合果酒的發(fā)酵工藝及香氣成分進(jìn)行了分析研究。由于二氯甲烷與氟利昂、戊烷、己烷、乙醚等萃取溶劑相比較,具有萃取香氣物質(zhì)峰面積大、萃取比率高、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)。因此本研究采用二氯甲烷萃取溶劑對(duì)草莓柿子復(fù)合果酒中的香味物質(zhì)進(jìn)行萃取,結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)聯(lián)用技術(shù)對(duì)香味物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè),并比較分析其發(fā)酵過(guò)程中的香氣變化,旨在為草莓柿子復(fù)合果酒的生產(chǎn)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

草莓、柿子、白砂糖(一級(jí)品) 市售;檸檬酸(食品級(jí)) 河北源創(chuàng)生物科技有限公司;果膠酶(2000 U/g) 浙江綠洲生物技術(shù)有限公司;果酒專用酵母 安琪酵母股份有限公司;二氯甲烷、亞硫酸(均為分析純) 天津市大茂化學(xué)試劑廠;無(wú)水硫酸鈉(分析純) 天津市瑞金特化學(xué)品有限公司;乙烯利 安陽(yáng)市小康農(nóng)藥有限責(zé)任公司。

7890-5975C型氣質(zhì)聯(lián)用儀(GC-MS) Agilent Technologies;SPX-100B-Z型生化培養(yǎng)箱 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司;FHS-3E型pH計(jì) 上海佑科儀器有限公司;JJ-2型組織搗碎勻漿機(jī) 江蘇省金壇市菜華儀器制造有限公司;RE-2000A型有機(jī)相旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞容生化儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 草莓柿子復(fù)合果酒釀制工藝流程

1.2.2 操作要點(diǎn) 挑選新鮮、無(wú)霉?fàn)€變質(zhì)、無(wú)損傷的草莓和柿子,先對(duì)柿子進(jìn)行脫澀(加入500 mg/kg乙烯利),然后分別對(duì)草莓和柿子清洗、去蒂、打漿,打漿時(shí)加入100 mg/L的亞硫酸,然后按草莓∶柿子∶水比例為1∶2∶3進(jìn)行混合,加入0.5%的果膠酶于45 ℃酶解3 h,用白砂糖、檸檬酸進(jìn)行成分調(diào)整(糖度調(diào)至15.7%,pH為4.27),然后加入2%活化的釀酒酵母(稱取1 g酵母,加入到20 g含5%糖水中,在38 ℃條件下活化15～30 min),攪拌均勻后,放入28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)發(fā)酵7 d左右(殘?zhí)墙抵?%以下),發(fā)酵結(jié)束后過(guò)濾除渣,酒液在室溫下陳釀一個(gè)月。

1.2.3 草莓柿子復(fù)合果酒香氣成分的萃取 參考王玉峰等[15]的方法并加以改進(jìn)。分別量取發(fā)酵至第0 d(發(fā)酵起點(diǎn))、4 d(發(fā)酵中點(diǎn))、7 d(發(fā)酵終點(diǎn))、17 d(陳釀10 d)、27 d(陳釀20 d)、37 d(陳釀30 d)的復(fù)合果酒100 mL,依次用80、60、50 mL的二氯甲烷常溫下萃取3次,合并有機(jī)相,在30 ℃下濃縮至5 mL,無(wú)水硫酸鈉脫水后,再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮至1 mL,用 0.22 μm濾膜過(guò)濾后供GC-MS分析。

1.2.4 GC-MS條件 GC條件:DB-FFAP毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm);自動(dòng)進(jìn)樣,進(jìn)樣量1 μL;進(jìn)樣口溫度250 ℃;載氣為純He;載氣流量為1.0 mL/min;升溫程序:柱溫初始溫度45 ℃,保持5 min,再以5 ℃/min升溫至240 ℃,保持5 min;分流進(jìn)樣,分流比為25∶1。

MS條件:電子電離源(EI);電子能量70 eV;離子源溫度230 ℃;MS四極桿溫度150 ℃;質(zhì)量掃描范圍50～550 u。

1.2.5 香氣成分定性定量分析 定性:檢測(cè)出的未知化合物與NIST.11 library相匹配,根據(jù)匹配度,并結(jié)合已有的文獻(xiàn)進(jìn)行定性;定量:通過(guò)峰面積歸一化法確定不同香味成分的相對(duì)含量。

1.2.6 微生物檢測(cè) 參照NY/T1508-2017《綠色食品 果酒》對(duì)陳釀一個(gè)月的果酒進(jìn)行微生物限量檢測(cè)[16]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Office Excel 2007軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵過(guò)程中草莓柿子復(fù)合果酒香味成分的總離子流圖

采用二氯甲烷對(duì)復(fù)合果酒的香味成分進(jìn)行萃取,經(jīng)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC/MS)分析鑒定,復(fù)合果酒發(fā)酵過(guò)程中第0、4、7、17、27、37 d香味成分的總離子流圖見(jiàn)圖1。由圖1可知,隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),色譜峰的數(shù)量隨之增加,各色譜峰的峰面積發(fā)生著動(dòng)態(tài)變化,發(fā)酵至第37 d時(shí),色譜峰數(shù)量達(dá)到最大值,表明果酒發(fā)酵至第37 d時(shí)各種香味成分已基本形成,果酒的香氣趨于穩(wěn)定、持久。

圖1 草莓柿子復(fù)合果酒發(fā)酵過(guò)程中香味成分的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogrom of aroma components of strawberry persimmon compound fruit wine in different fermentation stage

2.2 草莓柿子復(fù)合果酒發(fā)酵過(guò)程中香味成分的分析

由表1可知,整個(gè)發(fā)酵過(guò)程共測(cè)出63種香味成分,其中12種酯類、11種醇類、10種酸類、5種酮類、13種烷烴類、12種其它類(4種烯類、3種胺類、1種苯類、1種醚類、1種酚類、1種醛類、1種喹啉類)。復(fù)合果酒發(fā)酵第0 d未測(cè)出香味成分;第4 d檢測(cè)出2種物質(zhì),分別為正戊醇57.68%、苯乙醇36.39%;第7 d檢測(cè)出12種物質(zhì),主要有異戊醇45.67%、苯乙醇38.06%;第17 d檢測(cè)出26種物質(zhì),主要有異戊醇30.62%、亞油酸17.97%、苯乙醇14.55%;第27 d檢測(cè)出37種物質(zhì),主要有正戊醇40.69%、苯乙醇24.68%;第37 d檢測(cè)出54種物質(zhì),主要有正戊醇、苯乙醇24.69%、26.24%。結(jié)果表明,隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),香味成分的種類、相對(duì)含量發(fā)生著各種變化,由于香味物質(zhì)的氧化、還原、酯化等化學(xué)反應(yīng),使復(fù)合果酒香氣向更濃厚、持久、穩(wěn)定的方向轉(zhuǎn)化,趨于平衡、融合、協(xié)調(diào)[19];醇類、酯類、酸類、酮類等各種香氣物質(zhì)呈現(xiàn)不同的香味特征,它們之間通過(guò)增效、協(xié)同、分離以及抑制等相互作用,使復(fù)合果酒的香氣千變?nèi)f化、多種多樣[20]。

表1 草莓柿子復(fù)合果酒發(fā)酵過(guò)程中香味成分GC/MS分析結(jié)果Table 1 GC/MS analysis results of aroma components of strawberry persimmon compound fruit wine in different fermentation stage

續(xù)表

2.3 發(fā)酵過(guò)程中香味成分種類分析

2.3.1 草莓、柿子復(fù)合果酒發(fā)酵過(guò)程中各香味成分種類數(shù)量的變化分析 草莓、柿子復(fù)合果酒發(fā)酵第0、4、7、17、27、37 d的各香味成分種類數(shù)量見(jiàn)表2。

由表2可知,隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),各類香味成分的種類數(shù)量均呈上升趨勢(shì),其中酯類香味成分種類最多,是果酒香型的特征性成分,能使酒體柔和順暢,香氣豐滿持久;醇類次之,其中的高級(jí)醇不僅能夠賦予酒優(yōu)雅的香氣,同時(shí)又是其它香味物質(zhì)的良好溶劑,對(duì)總體香型的形成具有重要的提攜作用;酸類香味成分種類雖然不多,但有助于提高果酒的利口性,使酒體爽冽[21];酮類、烷烴類、其它類等香味成分也在香氣形成中具有不可忽視的作用。

表2 復(fù)合果酒發(fā)酵過(guò)程中第0、4、7、17、27、37 d中各香味成分種類數(shù)量Table 2 The number of aroma components on days 0,4,7,17,27 and 37 of compound fruit wine in fermentation process

2.3.2 發(fā)酵過(guò)程中酯類香味成分變化分析 由圖2可知,在第0～37 d的發(fā)酵過(guò)程中,酯類物質(zhì)的相對(duì)含量呈上升趨勢(shì),其相對(duì)含量?jī)H次于醇類物質(zhì),其中相對(duì)含量較高的酯類物質(zhì)為丁二酸單乙酯(0.99%)、正己酸乙酯(0.30%)、辛酸乙酯(0.28%)、乙酸異戊酯(0.28%)等,這與王孝榮[22]、梁葉星[23]對(duì)草莓果酒香氣成分分析的研究結(jié)果相似。這些酯類化合物的相對(duì)含量雖然不高,但由于其香氣的閾值低,香氣值(濃度/閾值)高,加之風(fēng)味獨(dú)特,可以賦予復(fù)合果酒果香和花香的感官特性,對(duì)復(fù)合果酒風(fēng)味的改善具有巨大貢獻(xiàn)[24]。

圖2 復(fù)合果酒發(fā)酵過(guò)程中酯類物質(zhì)的相對(duì)含量變化Fig.2 Relative content changes of esters substances of compound fruit wine in fermentation process

2.3.3 發(fā)酵過(guò)程中醇類香味成分變化分析 由圖3可知,在第0～37 d的發(fā)酵過(guò)程中,醇類物質(zhì)的相對(duì)含量呈先下降后上升趨勢(shì),其相對(duì)含量是最大的一類物質(zhì),其中相對(duì)含量較高的醇類物質(zhì)為正戊醇(57.68%)、異戊醇(45.67%)、苯乙醇(45.67%)、對(duì)羥基苯乙醇(4.24%),這與劉曉艷[25]對(duì)柿子果酒香氣成分的GC-MS分析結(jié)果基本一致。這些醇類物質(zhì)主要來(lái)源于發(fā)酵、氨基酸的轉(zhuǎn)化及亞麻酸降解物的氧化[26],在復(fù)合果酒中起呈香、呈味作用,與酸類、酯類物質(zhì)含量配比恰當(dāng),有助于果酒的呈香。

圖3 復(fù)合果酒發(fā)酵過(guò)程中醇類物質(zhì)的相對(duì)含量變化Fig.3 Relative content changes of alcoholic substances of compound fruit wine in fermentation process

2.3.4 發(fā)酵過(guò)程中酸類香味成分變化分析 由圖4可知,在第0～37 d的發(fā)酵過(guò)程中,酸類物質(zhì)相對(duì)含量呈先上升后下降趨勢(shì),是相對(duì)含量排第三的化合物,其中相對(duì)含量較高的酸類物質(zhì)為亞油酸(17.97%)、棕櫚酸(7.24%)、新癸酸(3.45%)、正辛酸(1.73%)、肉豆蔻酸(0.68%),這些酸類物質(zhì)產(chǎn)生于脂肪酸合成酶的合成以及脂質(zhì)β-氧化的降解,具有明顯的脂肪味,對(duì)復(fù)合果酒的整體結(jié)構(gòu)具有較為重要的作用[27]。

圖4 復(fù)合果酒發(fā)酵過(guò)程中酸類物質(zhì)的相對(duì)含量變化Fig.4 Relative content changes of acids substances of compound fruit wine in fermentation process

2.3.5 發(fā)酵過(guò)程中酮類香味成分變化分析 由圖5可知,在第0～37 d的發(fā)酵過(guò)程中,酮類物質(zhì)的相對(duì)含量呈上升趨勢(shì),相對(duì)含量較高的酮類物質(zhì)為4-羥基-2,5-二甲基-3(2H)-呋喃酮(0.48%)、4-甲氧基-2,5-二甲基-3(2H)-呋喃酮(0.22%)、姜酮(0.19%)等。其中4-羥基-2,5-二甲基-3(2H)-呋喃酮(俗名菠蘿呋喃酮),嗅覺(jué)閾值低,香氣值(濃度/閾值)高,并且具有焦糖的獨(dú)特香味,是構(gòu)成復(fù)合果酒特征香氣成分最主要的一種酮類物質(zhì)[28]。

圖5 復(fù)合果酒發(fā)酵過(guò)程中酮類物質(zhì)的相對(duì)含量變化Fig.5 Relative content changes of ketones substances of compound fruit wine in fermentation process

2.3.6 發(fā)酵過(guò)程中烷烴類香味成分變化分析 從圖6可知,在0～7 d的發(fā)酵期間,未檢測(cè)到烷烴類香味物質(zhì);在發(fā)酵第17 d時(shí),烷烴類香味物質(zhì)的相對(duì)含量最大;在發(fā)酵17～37 d期間,呈先下降后上升趨勢(shì),相對(duì)含量較高的烷烴類香味物質(zhì)為正二十一烷(2.29%)、N-二十九烷(2.31%)。烷烴類物質(zhì)含量較低,可能是因?yàn)榘l(fā)酵過(guò)程中其氧化分解,降解為醇類、醛類、酮酸類等對(duì)果酒品質(zhì)有重要貢獻(xiàn)的香氣物質(zhì)[29]。

圖6 復(fù)合果酒發(fā)酵過(guò)程中烷烴類物質(zhì)的相對(duì)含量變化Fig.6 Relative content changes of alkane substances of compound fruit wine in fermentation process

2.3.7 發(fā)酵過(guò)程中其它類香味成分變化分析 由圖7可知,在發(fā)酵0～7 d期間,未檢測(cè)到其它類香味物質(zhì);在發(fā)酵第17 d時(shí),其它類香味物質(zhì)相對(duì)含量最高;在發(fā)酵17～37 d期間,其它類香味物質(zhì)呈先下降后上升趨勢(shì),相對(duì)含量較高的烯類化合物為順式-9-二十三烯(7.52%)、右旋萜二烯(0.39%)。烯類化合物屬于植物體中由乙酰CoA合成的次級(jí)代謝產(chǎn)物,以游離態(tài)和無(wú)味的糖苷結(jié)合態(tài)存在于植物果實(shí)中,具有濃郁的香味,其感覺(jué)閾值較低,但香氣值很高,對(duì)果酒的香氣組成起著不可忽視的作用[30-31]。

圖7 復(fù)合果酒發(fā)酵過(guò)程中其它香味類物質(zhì)的相對(duì)含量變化Fig.7 Relative content changes of other aroma substances of compound fruit wine in fermentation process

2.4 復(fù)合果酒微生物指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

依照NY/T1508-2017《綠色食品 果酒》對(duì)果酒進(jìn)行微生物指標(biāo)檢測(cè),結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 復(fù)合果酒微生物指標(biāo)測(cè)定結(jié)果Table 3 Microbe parameters of compound fruit wine

由表3可知,復(fù)合果酒經(jīng)微生物檢測(cè),菌落總數(shù)、大腸菌群、致病菌均符合標(biāo)準(zhǔn)要求。

3 結(jié)論

草莓、柿子復(fù)合果酒中在發(fā)酵過(guò)程中共檢測(cè)出63種香味成分,其中12種酯類、11種醇類、10種酸類、5種酮類、13種烷烴類、12種其它類。其中正戊醇、異戊醇、苯乙醇、亞油酸和對(duì)羥基苯乙醇等香味成分的含量較高,含量最高時(shí)分別為57.68%、45.67%、38.06%、17.97%、4.81%。發(fā)酵初期未檢測(cè)到香味成分,隨著發(fā)酵的進(jìn)行出現(xiàn)了醇類、酯類、酸類等物質(zhì),香味成分種類數(shù)量隨之增多,在發(fā)酵過(guò)程中酯類、酮類物質(zhì)相對(duì)含量呈上升趨勢(shì),醇類物質(zhì)呈先下降后上升趨勢(shì),酸類物質(zhì)呈先上升后下降趨勢(shì),其中醇類物質(zhì)相對(duì)含量最高,酯類物質(zhì)次之。