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(1.四川省原子能研究院,四川成都 610101; 2.輻照保藏四川省重點實驗室,四川成都 610101; 3.成都中科能源環(huán)保有限公司,四川成都 610041)

美味牛肝菌(Boletusedulis),又名白牛肝菌,屬擔子菌亞門(Basidiomycotina)、層菌綱(Hymenomycetes)、傘菌目(Agarieases)、牛肝菌科(Boletaceae)[1]。美味牛肝菌滋味鮮美,營養(yǎng)豐富,還具有較高的藥用價值,是一種世界著名的大型食用菌,在我國分布廣泛[2-4],目前已知種類有390多種,其中199種為可食用的種類[5]。

由于美味牛肝菌的新鮮子實體含水量高、生理代謝活躍,導致其貨架期極短,即便4 ℃條件下,也僅能保存7 d左右[6]。脫水干制是食用菌子實體常用的保藏方法之一,但子實體中所攜帶的各類微生物仍會嚴重影響其干品的貨架期[7]。輻照保藏技術主要是指利用γ-射線、X射線或高能電子束對食品、農產品或其原材料進行處理,以實現消毒、滅菌、殺蟲、防霉以及抑制農產品后熟等目的,在保證產品品質的基礎上,可有效延長食品及農產品的貨架期[8-9],已廣泛應用于各類食用菌的保鮮及保藏中[10-11]。該技術具有無污染、無放射性殘留、不破壞營養(yǎng)成分、加工效率高及能耗低等優(yōu)點,其安全性得到如世界衛(wèi)生組織(WHO)、國際原子能機構(IAEA)、聯合國糧農組織(FAO)以及美國食品和藥品管理局(US-FDA)等權威機構的確認,是一種具有較大應用前景的物理保藏方法[12-14]。Lescano等[15]對雙孢菇進行3 kGy的γ-輻照后,在約10 ℃,94%左右的相對濕度條件下貯藏11 d,風味無顯著差異;Jiang等[16]利用1.0、1.5 kGy的γ-輻照處理香菇并結合氣調包裝,可將其貨架期延長至20 d。但關于輻照處理美味牛肝菌的研究報道較少。另一方面,食用菌風味是影響食用菌品質及接受度的重要特征之一,而其中的揮發(fā)性成分則是影響食用菌風味的關鍵[17],目前關于輻照對美味牛肝菌揮發(fā)性成分影響的研究也還不多。

本試驗采用頂空固相微萃取結合氣相色譜-質譜聯用技術(Headspace solid-phase micro-extraction gas chromatography mass spectrometry,HS-SPME-GC-MS)分析不同劑量輻照處理對美味牛肝菌干品揮發(fā)性成分的作用,為輻照技術在美味牛肝菌保藏中的應用提供有效的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

美味牛肝菌干品 購自當地大型超市,將樣品粉碎后過40目篩備用。

HP6890-5973型氣相色譜-質譜聯用儀 美國Agilent公司;Supelco固相微萃取裝置,75 μm Car/PDMS(碳分子篩/聚二甲基硅氧烷)萃取頭 美國Supelco公司;MS104S型分析天平 瑞士Mettler Toledo公司(精度0.1 mg);JYL-C025型小型粉碎機 九陽股份有限公司;200萬居里全自動60Co-γ輻照裝置 四川省原子能研究院輻照工程中心。

1.2 實驗方法

1.2.1 輻照處理 將牛肝菌干粉用鋁箔復合袋裝好后,送至四川省原子能研究院輻照工程中心,使用全自動60Co-γ輻照裝置進行輻照處理,設置高(3.30 kGy)、低(1.30 kGy)兩個劑量處理組,溫度為25 ℃,輻照處理時間約95 min,輻照源劑量率為35 Gy/min,以重鉻酸銀劑量計,測定樣品的吸收劑量并確定其最終的輻照處理劑量為3.38、1.29 kGy,未經輻照處理的樣品設為對照(CK)。

1.2.2 固相微萃取 準確稱取5.0000 g美味牛肝菌干粉裝入15 mL采樣瓶中,將采樣瓶置于45 ℃水浴鍋中平衡溫度,插入萃取頭頂空吸附30 min,萃取后立刻插入GC進樣口,于250 ℃脫附5 min后進行分析檢測[18-19]。

1.2.3 GC-MS分析條件 色譜柱為HP-INNOVWAX彈性石英毛細管柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm);升溫程序:色譜柱初始溫度60 ℃,保持5 min,以5 ℃/min升溫至200 ℃,保持3 min;以10 ℃/min升溫至260 ℃,保持10 min;進樣口溫度250 ℃,載氣為高純He(99.999%),流速1.0 mL/min,分流比2∶1。質譜條件:離子化方式為電子轟擊電離(EI),電子能量70 eV,離子源溫度250 ℃,四級桿溫度150 ℃,質譜接口溫度260 ℃,掃描范圍為m/z 50～550。

1.3 數據處理

揮發(fā)性成分經質譜掃描后,得到總離子流量圖譜,對質譜圖進行圖譜庫檢索(WILEY+NIST),匹配度大于80%作為判定依據。按峰面積歸一化法求得樣品中各揮發(fā)性成分的相對含量。實驗結果均為3次測定的平均值,利用PASW Statistics 18軟件對結果進行ANOVA分析,顯著性水平設置為p<0.05。

2 結果與分析

2.1 不同輻照處理后美味牛肝菌揮發(fā)性成分GC-MS總離子流圖分析

美味牛肝菌干粉經過不同輻照劑量處理后,其揮發(fā)性成分的總離子色譜圖如圖1所示。

圖1 不同劑量輻照處理的美味牛肝菌干品揮發(fā)性成分GC-MS總離子色譜圖Fig.1 GC-MS total ion current chromatogram of volatile components in dried B. edulis treated by 60Co-γ irradiation at different doses注:A：CK;B:1.29 kGy;C:3.38 kGy。

從圖1A～圖1C可見,GC-MS圖譜基線穩(wěn)定且噪聲低,可有效分離美味牛肝菌中各類揮發(fā)性成分,鑒定出的揮發(fā)性成分出峰時間主要集中在6～40 min之間。美味牛肝菌經不同劑量輻照處理后,揮發(fā)性成分的響應值發(fā)生不同程度的改變,表明不同劑量的輻照處理對牛肝菌中各揮發(fā)性成分產生了不同的作用。

2.2 美味牛肝菌揮發(fā)性成分的SPME-GC-MS鑒定

利用工作站對數據進行處理,并采用面積歸一化法計算各組分相對含量,按各峰的質譜圖進行質譜數據譜庫檢索,共鑒定出43種揮發(fā)性成分,其組成和相對含量如表1所示。

表1 輻照處理對美味牛肝菌揮發(fā)性成分作用的GC-MS分析結果Table 1 Effects of irradiation treatment with different doses on volatile components of B.edulis

分析表1結果(CK)可知,美味牛肝菌揮發(fā)性成分構成復雜,主要由吡嗪類、烴類、醛類、酮類、酸類、酚類、酯類、雜環(huán)及呋喃類等共43種化合物組成,分別是7種吡嗪類,4種烴類,1種醛類,1種酮類,5種酚類,2種酯類,8種酸類,11種雜環(huán)類,另外還有4種未知化合物。由表2可得，這些化合物中,相對含量最高的是酸類,為28.43%,然后依次為吡嗪類18.11%,烴類17.41%,雜環(huán)及呋喃類17.25%,醛類5.89%,酚類3.41%和酯類1.88%。其中相對含量大于3%的揮發(fā)性成分有2-癸烯(6.73%),2,5-二甲基吡嗪(6.69%),2,6-二甲基吡嗪(6.54%),十四烷(5.34%),乙酸(4.81%),苯甲醛(5.89%),十六烷(3.87%),2-甲醛-噻吩(3.6%),2-乙酮基-吡咯(6.23%),棕櫚酸(10.54%),油酸(4.22%),亞油酸(4.41%),這些化合物應是美味牛肝菌中主要的揮發(fā)性成分。

表2 美味牛肝菌中主要揮發(fā)性成分類別及其總相對含量Table 2 Classifications and their total relative contents of the main volatile components of B.edulis

食用菌的風味與其揮發(fā)性成分的氣味閾值、構成及含量密切相關[20-21]。分析表1結果并查閱文獻可知,美味牛肝菌中含大量風味物質。吡嗪類是美味牛肝菌中種類較多,含量較高的揮發(fā)性成分,相對含量達18.11%。這些化合物是多種食品重要的香味成分,閾值較低,通常由食用菌中糖和氨基酸發(fā)生美拉德反應而生成[22],具有愉悅的堅果、烘烤、焦糖、清香、泥土香等香味[21,23-24],如2,6-二甲基吡嗪(相對含量6.54%)具有烤堅果香;2,5-二甲基吡嗪(相對含量6.69%)具有堅果、土豆、脂肪香;三甲基吡嗪(相對含量0.3%)具有烘烤、堅果類香味,吡嗪化合物對美味牛肝菌特征風味的形成具有重要貢獻。

含氮含硫及雜環(huán)化合物(相對含量17.25%)是美味牛肝菌中含量較高的一大類化合物,對其風味的產生也有重要作用。2-戊基呋喃(相對含量0.65%)可能是亞油酸氧化的產物,具有豆香、果香、泥土、青香味,且氣味閾值很低(4×10-9g/mL);呋喃酮類(相對含量2.32%)具有蘋果、草莓等水果風味[25];吡咯類化合物是廣泛存在于食品中的含氮雜環(huán)類化合物,通常具有甜味、玉米香味、焦糖味、烤香味等令人愉悅的風味[26],GC-MS結果表明,美味牛肝菌中三種吡咯類化合物的相對含量為6.73%,是其特征風味的重要組成部分。

醛類化合物主要由脂質氧化或Strecker反應降解產生,香味閾值普遍較低[17]。苯甲醛(相對含量5.89%)一般由苯丙氨酸降解生成,具有愉快的杏仁香、花香[27];酮類化合物也具有獨特的香味,且香味閾值較低[28]。2-十一酮(相對含量1.37%)具有蠟香、脂肪香并伴有水果奶油味,對美味牛肝菌特殊風味的產生有一定貢獻[29];酯類物質一般是由脂肪氧化產生的醇和游離的脂肪酸作用形成,如棕櫚酸乙酯(相對含量1.73%)呈微弱蠟香、果香和奶油香氣,可用于香精香料生成中[30];環(huán)丁內酯,又稱γ-丁內酯(相對含量0.15%),具有輕微的甜奶油味,是國標GB 2760允許添加的香精[31]。酯類成分的特殊風味對美味牛肝菌香味也有一定的貢獻。

美味牛肝菌中酸類成分相對含量為28.43%,是GC-MS鑒定的揮發(fā)性成分中含量最高的一類化合物,通常具有酸味、奶酪味等風味,但其氣味閾值較高,一般起到調節(jié)美味牛肝菌風味的作用[17,29];酚類化合物(相對含量3.41%)通常用于制作香精,具有一定的香味,如2,6-二甲氧基苯酚(相對含量2.26%),具有甜香、木香味;2-甲氧基-4-甲基苯酚(相對含量0.2%),具有辛香、丁香、香莢蘭氣味,均是國標GB 2760中規(guī)定可以使用的香精。另一方面,本研究檢測到美味牛肝菌中烷烴的相對含量也比較高,達到17.41%,但通常情況下,飽和烷烴的香味閾值都比較高,對美味牛肝菌風味產生的貢獻較小[21]。

有研究表明,八碳及以下的揮發(fā)性化合物是決定食用菌風味的關鍵成分[19,32]。根據GC-MS分析結果,美味牛肝菌中共鑒定出23種含八碳及以下的揮發(fā)性化合物,其總體相對含量達到48.16%。因此,干制美味牛肝菌中小分子揮發(fā)性成分是其風味產生重要組分。另外,美味牛肝菌在干制時,子實體中氨基酸及多肽類化合物產生熱解反應,糖類和氨基酸產生相互作用,影響干制品的風味的呈現,如1-辛烯-3-醇,1-辛烯-4-醇等是大型食用菌重要的風味化合物,但在本研究中這些物質均未檢出,這可能是由于它們穩(wěn)定性低,在美味牛肝菌的干制過程中這類物質發(fā)生降解所致[21]。

2.3 輻照處理對美味牛肝菌揮發(fā)性風味成分的影響

對美味牛肝菌進行輻照處理時,一方面,射線的能量可導致微生物的重要成分,如DNA、蛋白質等大分子中化學鍵的斷裂,還可引起DNA-蛋白質交聯及DNA堿基的改變,達到消毒、滅菌等效果[33];另一方面,輻照處理還可能對美味牛肝菌中揮發(fā)性成分產生影響[13]。如表1和表2所示,不同劑量的60Co-γ輻照處理對美味牛肝菌中揮發(fā)性成分產生了不同的影響。經兩種劑量(1.29和3.38 kGy)的輻照處理后,吡嗪類化合物的相對含量有明顯降低(p<0.05),分別從對照組的18.11%降低到15.51%和14.98%,降低了14.36%和17.28%;輻照處理能顯著降低美味牛肝菌中雜環(huán)類化合物的相對含量(p<0.05),輻照后從對照組的17.25%降低到14.75%和14.27%,降低了14.49%和17.27%,但實驗中兩種劑量處理后雜環(huán)類化合物的相對含量變化不顯著(p>0.05);醛類及酮類化合物的相對含量也有顯著降低(p<0.05),苯甲醛從對照組的5.89%降低到3.78%和4.77%,降低了35.82%和19.02%;2-十一酮從對照組的1.37%降低到0.98%和0.98%,降低了28.47%和28.47%,不同輻照劑量處理對2-十一酮含量影響不顯著(p>0.05)。進一步分析表明,八碳及以下揮發(fā)性化合物的總相對含量在輻照前后也出現明顯變化(p<0.05),從對照組的48.16%降低到42.73%和42.50%,降低了11.27%和11.75%,而實驗所用兩種輻照劑量處理后八碳及以下揮發(fā)性化合物的總相對含量變化也不顯著(p>0.05)。此外,烴類相對含量則從對照組的17.41%降低到9.31%和8.87%,降低了46.52%和49.05%(p<0.05)。γ-輻照處理能顯著降低美味牛肝菌中主要揮發(fā)性風味成分的相對含量,可能是由于電離輻射的次生效應生成了水合電子、OH和H等自由基,這些自由基對這幾類揮發(fā)性成分有較強的氧化降解作用,從而導致上述揮發(fā)性成分相對含量的降低[10,34]。以上結果表明,對美味牛肝菌干品進行輻照處理時,應采取適當的措施,如包裝方式、溫度、抗氧化劑等,降低射線對美味牛肝菌中風味物質的影響,保證產品的品質。

輻照處理后,美味牛肝菌中酚類成分的相對含量呈先上升后下降的趨勢,變化顯著(p<0.05),1.29 kGy輻照后的酚類成分相對含量最高,達7.26%,相對于對照樣品提高了112.90%,可能是低劑量處理促進了美味牛肝菌中酚類物質的生成,這與前人的研究結果類似[16,35-36]。

輻照處理后美味牛肝菌中8種酸類成分的總相對含量顯著增加(p<0.05),從對照組的28.43%上升至31.04%(1.29 kGy)和41.38%(3.38 kGy),提高了9.18%和45.55%,由于烴類化合物主要來源于脂肪酸烷氧自由基的均裂,而羧酸類成分一般通過發(fā)酵或脂質代謝產生[37],本實驗采用的輻照處理劑量可能對酸類成分的產生有促進作用而對烴類成分有降解效應,但此兩種輻射劑量并不足以氧化酸類成分,因而提高了輻照后美味牛肝菌中8種酸類成分的總相對含量，但烴類化合物含量出現降低,此現象與Aprea等[38]的研究結果相符。

3 結論

通過HS-SPME-GC-MS分析不同劑量輻照處理對美味牛肝菌干品揮發(fā)性成分的影響,結果表明,美味牛肝菌揮發(fā)性成分主要由酸類、吡嗪類、烴類、醛類、酮類、酚類、酯類、雜環(huán)及呋喃類等化合物組成,八碳及以下化合物有23種,其總相對含量達48.16%,小分子化合物是美味牛肝菌主要揮發(fā)性成分。輻照對美味牛肝菌中的吡嗪類、醛類、酮類、雜環(huán)及呋喃類等主要揮發(fā)性成分以及八碳及以下的化合物有降解作用,并隨輻照劑量的升高,大部分風味相關的揮發(fā)性成分的降解程度有升高趨勢,表明輻照處理對美味牛肝菌風味有一定的影響,在輻照處理時,應采取適當措施來降低輻照對美味牛肝菌風味的影響。本研究結果可為輻照技術在美味牛肝菌保藏中的應用提供了試驗數據。