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(西南科技大學(xué)植物分子遺傳育種實(shí)驗(yàn)室,四川綿陽 621010)

黑米是稻米中的珍貴品種,不僅含有豐富的蛋白質(zhì)、人體所必需的氨基酸、不飽和脂肪酸、維生素C 及鈣、鐵、鋅等礦物營養(yǎng)元素,還含有具藥用價(jià)值的花青素[1]。花青素屬于植物多酚中的類黃酮類物質(zhì),是廣泛存在于自然界中的一類水溶性天然色素,具有抗氧化性、預(yù)防心腦血管疾病與癌癥、保護(hù)肝臟與視力等功能[2],在食品、醫(yī)藥、化妝品等方面都有重要的應(yīng)用[3-4]。我國黑米種質(zhì)資源十分豐富,現(xiàn)收集保存的就有373個(gè)[5]。于斌等[6]研究認(rèn)為黑米花青素可能通過抑制移植瘤內(nèi)血管生成而抑制腫瘤生長,韓彬等[7]發(fā)現(xiàn)黑米花青素能夠抑制乳腺癌細(xì)胞異種移植瘤向肺轉(zhuǎn)移,該抑制作用可能與黑米花青素抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡有關(guān),Wen等[8]研究發(fā)現(xiàn),從紫甘薯提取的花青素與現(xiàn)有的食品防腐劑苯甲酸鈉和山梨酸鉀相比有增強(qiáng)的抗真菌特性,所以深入研究花青素的提取工藝對黑米的開發(fā)與深加工具有重要意義。

因?yàn)楹诿谆ㄇ嗨氐闹匾?其不同介質(zhì)的提取工藝受到廣泛關(guān)注;由于乙醇無毒且易去除,因此黑米花青素的乙醇提取工藝成為研究的焦點(diǎn)。侯召華等[9]通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交試驗(yàn)得出黑米花青素最佳提取條件為提取液乙醇-水-鹽酸體積比為50∶50∶0.5，溫度50 ℃，固液比為1∶10 (g∶mL)，提取時(shí)間為1 h，提取次數(shù)為3次;Bae等[10]研究黑米花青素提取的優(yōu)化工藝后認(rèn)為,乙醇體積分?jǐn)?shù)50.78%和1 N HCl(0.60 mL)的提取產(chǎn)物中矢車菊-3-葡萄糖苷含量能達(dá)到624.27 mg。吳素萍[11]利用單因素實(shí)驗(yàn)和正交試驗(yàn)得到最佳提取工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)50%,粉碎度50目,料液比1∶5,浸提時(shí)間30 min,浸提溫度80 ℃,浸提pH為3;石娟[12]通過單因素和正交試驗(yàn)得到黑米花青素最佳提取條件為:提取時(shí)間100 min、提取溫度40 ℃、料液比1∶8、pH3.2;吳娟等[13]利用萃取法對黑米花青素提取工藝進(jìn)行研究,得到最佳條件是以無水乙醇為萃取劑，料液比1∶8，萃取時(shí)間60 min，溫度80 ℃。嚴(yán)紅光等[14]在以兔眼藍(lán)莓果渣為原料、乙醇為提取溶劑提取花青素的研究中發(fā)現(xiàn),乙醇體積分?jǐn)?shù)是影響花青素提取率高低的最主要因素。張莉弘等以藍(lán)莓為原料、乙醇為提取溶劑的花青素提取研究中,顯示提取溫度是影響花青素得率的最主要因素[15]。從上述結(jié)果看,其現(xiàn)有提取工藝條件存在較大差異。

花青素在可見光區(qū)域的最大吸收波長在500～550 nm范圍內(nèi)。田喜強(qiáng)等[16]掃描黑米花青素提取液的吸收光譜,發(fā)現(xiàn)其最大吸收波長為530 nm。因此,本研究選用530 nm作為最大吸收波長檢測在各試驗(yàn)條件下的光密度(optical density,OD)值,在單因素實(shí)驗(yàn)和正交試驗(yàn)中暫時(shí)以O(shè)D值代表花青素含量。目前花青素的提取工藝雖有報(bào)道,但對黑米花青素的提取還缺少一套完整的體系,并且黑米花青素的提取率都急需提高。所以本試驗(yàn)采用無水乙醇為提取液提取黑米花青素,通過單因素和正交試驗(yàn)確定最佳溶劑濃度、提取溫度、料液比、提取時(shí)間及提取液pH以得到優(yōu)化的提取工藝,為黑米花青素的工業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

固城黑糯 西南科技大學(xué)植物分子遺傳育種實(shí)驗(yàn)室;無水乙醇 分析純,成都市科龍化工試劑廠;鹽酸 分析純,成都市欣海興化工試劑廠;矢車菊-3-葡萄糖苷 上海金穗生物科技有限公司。

TR-200電動(dòng)礱谷機(jī) 日本Kett;Lm3100高速錘式粉碎機(jī) 瑞典Perten;T6紫外分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司;DHP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司;5415R冷凍離心機(jī) 德國Eppendorf;PH2100型pH計(jì) 美國EUTECH;電子天平 美國DENVER。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 黑米花青素的單因素提取實(shí)驗(yàn) 參考石娟[12]及郭梅等[17]方法并進(jìn)行改進(jìn),將固城黑糯稻谷用電動(dòng)礱谷機(jī)脫殼為糙米,再用高速錘式粉碎機(jī)磨成過100目篩的黑米粉;取1 g黑米粉放入燒杯中,加入一定體積的乙醇,調(diào)節(jié)至一定pH,杯口用封口膜扎緊防止水分蒸發(fā),在一定溫度下浸提一定時(shí)間后,4000 r/min離心15 min,取上清液稀釋定容至100 mL,在530 nm的波長下測定吸光度OD值,提取1次;重復(fù)3次。

1.2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對花青素含量的影響 分別取5份1 g黑米粉放入燒杯中,固定料液比(質(zhì)量體積比)為1∶10 (g∶mL),提取時(shí)間為120 min,提取溫度為30 ℃,提取液pH為2,分別加入75%、80%、85%、90%、95%的無水乙醇,杯口用封口膜扎緊防止水分蒸發(fā),浸泡后,4000 r/min離心15 min,取上清液稀釋定容至100 mL,在530 nm的波長下測定吸光度,確定最佳乙醇濃度。

1.2.1.2 提取時(shí)間對花青素含量的影響 分別取5份1 g黑米粉放入燒杯中,固定提取溫度為30 ℃,提取液pH為2,乙醇體積分?jǐn)?shù)為90%,料液比(質(zhì)量體積比)為1∶10 (g∶mL),杯口用封口膜扎緊防止水分蒸發(fā),分別浸泡60、80、100、120、140 min后,4000 r/min離心15 min,取上清液稀釋定容至100 mL,在530 nm的波長下測定吸光度,確定最佳提取時(shí)間。

1.2.1.3 料液比對花青素含量的影響 分別取5份1 g黑米粉放入燒杯中,固定提取時(shí)間為120 min,提取溫度為30 ℃,提取液pH為2,乙醇體積分?jǐn)?shù)為90%,按料液比1∶7、1∶8、1∶9、1∶10、1∶11分別加入配好的乙醇溶液,杯口用封口膜扎緊防止水分蒸發(fā),浸泡設(shè)定時(shí)間后,4000 r/min離心15 min,取上清液稀釋定容至100 mL,在530 nm的波長下測定吸光度,確定最佳料液比。

1.2.1.4 提取溫度對花青素含量的影響 分別取5份1 g黑米粉放入燒杯中,固定提取液pH為2,乙醇體積分?jǐn)?shù)為90%,料液比(質(zhì)量體積比)為1∶10 (g∶mL),提取時(shí)間為120 min,杯口用封口膜扎緊防止水分蒸發(fā),分別置于30、40、50、60、70 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中浸泡設(shè)定時(shí)間后,4000 r/min離心15 min,取上清液稀釋定容至100 mL,在530 nm的波長下測定吸光度,確定最佳提取溫度。

1.2.1.5 提取液pH對花青素含量的影響 分別取5份1 g黑米粉放入燒杯中,固定乙醇體積分?jǐn)?shù)為90%,料液比(質(zhì)量體積比)為1∶10 (g∶mL),提取時(shí)間為120 min,提取溫度為30 ℃,調(diào)節(jié)溶液pH以0.5為梯度從1～3,杯口用封口膜扎緊防止水分蒸發(fā),浸泡設(shè)定時(shí)間后,4000 r/min離心15 min,取上清液稀釋定容至100 mL,在530 nm的波長下測定吸光度,確定最佳提取pH。

1.2.2 正交試驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,選取提取乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、提取時(shí)間、提取溫度和提取pH五個(gè)因素進(jìn)行5因素4水平的正交設(shè)計(jì),確定提取黑米花青素的最優(yōu)工藝。每個(gè)試驗(yàn)號測定OD值時(shí)重復(fù)3次。具體因素及水平見表1。

表1 黑米花青素提取工藝的正交因素與水平Table 1 Orthogonal test factors and levels of extracting process for black rice anthocyanin

1.2.3 確定最佳提取次數(shù) 根據(jù)正交試驗(yàn)優(yōu)化的提取工藝參數(shù),由鮑曉亮[18]、姚鈺蓉[19]的方法測定最佳提取次數(shù)。

相對提取率:P(%)=(∑An/∑AN)×100

式中，∑An-提取n次花青素吸光度總和；∑AN-提取N次(總次數(shù))花青素吸光度總和。

此相對提取率是指每次提取或者多次提取后在總獲得量中其所占比例的高低。

1.2.4 花青素含量和得率的測定 Pedro等[20]和He等[21]研究黑米花青素的提取和穩(wěn)定性時(shí),發(fā)現(xiàn)黑米中的主要花青素類型是矢車菊-3-葡萄糖苷,因此,以矢車菊-3-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。稱取10 mg矢車菊-3-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品溶于pH為2的乙醇溶液中,定容至10 mL為母液,再配成濃度分別為 10、20、30、40、50 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)液,用分光光度計(jì)測定吸光度。以矢車菊-3-葡萄糖苷濃度為橫坐標(biāo),以其吸光度值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得矢車菊-3-葡萄糖苷濃度為自變量、吸光度為因變量的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程,根據(jù)該方程可計(jì)算不同條件下的花青素含量。

提取的花青素總重量(μg)=(提取液體積×首次提取液的花青素含量×花青素相對總提取率)/首次花青素相對提取率

花青素得率(μg/g)=(提取的花青素總重量/樣品重量)=(提取液體積×首次提取液的花青素含量×花青素相對總提取率)/(首次花青素相對提取率×樣品重量)

1.3 數(shù)據(jù)分析

本研究中利用R軟件(v3.4.1)的lm()函數(shù)進(jìn)行模型擬合,anova()函數(shù)進(jìn)行方差分析;其它數(shù)據(jù)的分析和處理用Excel 2010進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 花青素單因素提取實(shí)驗(yàn)

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對花青素含量的影響 由圖1可以看出隨著乙醇濃度的升高,黑米提取液中的花青素含量在不斷增加;當(dāng)乙醇濃度為90%時(shí),其花青素含量最高,當(dāng)乙醇濃度大于90%后提取液中的花青素含量開始降低,其原因可能在于一些醇溶性雜質(zhì)以及親脂性強(qiáng)的成分溶出量增加,這些成分與花青素一起競爭同乙醇-水分子結(jié)合的機(jī)會,從而導(dǎo)致花青素含量下降[22]。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對花青素提取的影響Fig.1 Influence of ethanol volume fraction on the extracting efficiency of black rice anthocyanin

2.1.2 提取時(shí)間對花青素含量的影響 由圖2可知隨著提取時(shí)間的增加提取液中的花青素含量增加;當(dāng)提取時(shí)間為80 min時(shí)提取液中花青素的含量最多;之后隨著時(shí)間的繼續(xù)增加,提取液中花青素的含量卻緩慢下降,這可能是因?yàn)檫_(dá)到一定的時(shí)間后,提取出來的花青素慢慢的氧化了,同時(shí)隨著黑米中多糖及蛋白質(zhì)等大分子溶出增加,與花青素形成分子復(fù)合物增多,導(dǎo)致測量提取液中花青素含量時(shí)數(shù)值降低[23]。

圖2 提取時(shí)間對花青素提取的影響Fig.2 Influence of extracting time on the extracting efficiency of black rice anthocyanin

2.1.3 料液比對花青素含量的影響 由圖3可知從黑米中提取的花青素含量隨著液料比的增加而增加;當(dāng)液料比為1∶9時(shí),提取的花青素的含量達(dá)到最大;隨著料液比的繼續(xù)增加,提取液中的黑米花青素含量明顯下降,這可能是因?yàn)殡S著液料比的增大,其中水體積增加,使水中吸附更多的氧,使更多的黑米花青素氧化,造成提取液中的花青素含量降低[24]。

圖3 料液比對花青素提取的影響Fig.3 Influence of ratio of solid-liquid on the extracting efficiency of black rice anthocyanin

2.1.4 提取溫度對花青素含量的影響 由圖4可知,隨著溫度的升高,黑米花青素的提取效果越來越好,這可能是因?yàn)樵谙鄬^低的溫度下花青素與蛋白質(zhì)等結(jié)合物分離緩慢,使花青素的提取效果不理想;當(dāng)溫度升至50 ℃時(shí)提取效果最好;溫度大于50 ℃后,黑米花青素的提取效果緩慢下降。根據(jù)呂麗爽[22]分析,由于花青素藍(lán)色的醌式堿與紅色的黃佯鹽陽離子可逆,溫度過高后反應(yīng)平衡向查爾酮方向移動(dòng),其結(jié)果是顯色物質(zhì)含量下降。而且,較高溫度下,花青素結(jié)構(gòu)容易被破壞,這就導(dǎo)致提取液中花青素含量降低[25]。

圖4 溫度對花青素提取的影響Fig.4 Influence of temperature on the extracting efficiency of black rice anthocyanin

2.1.5 提取pH對花青素含量的影響 由圖5可知在黑米花青素的提取過程中,pH對提取液中的花青素含量有較大的影響。pH為2時(shí),花青素含量達(dá)到最大值;在pH較低時(shí)花青素含量也相對較大,這是因?yàn)榛ㄇ嗨卦谳^低的pH環(huán)境中有光和熱的穩(wěn)定性;pH大于2后,隨著pH的升高,花青素含量顯著下降,說明較大的pH會加速花青素的降解[26]。

圖5 pH對花青素提取的影響Fig.5 Influence of pH of extracting solution on the extracting efficiency of black rice anthocyanin

2.2 正交試驗(yàn)優(yōu)化工藝

正交試驗(yàn)首次提取花青素的OD值見表2。根據(jù)表2的正交結(jié)果及極差分析可知,5個(gè)因素中極差值最大的是因素E pH,最小值為因素D提取溫度,說明5個(gè)因素中pH對花青素提取量影響最大,而提取溫度影響最小,5個(gè)因素對黑米花青素得率高低的影響順序?yàn)閜H>提取時(shí)間>液料比>乙醇體積分?jǐn)?shù)>溫度。直接分析與計(jì)算得到的提取最優(yōu)水平一致,為A1B1C1D1E1,即乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%,提取時(shí)間為60 min,提取溫度為45 ℃,料液比為1∶7 (g∶mL),提取液pH為1。采用該優(yōu)化工藝后,花青素首次提取液的OD值達(dá)到0.637,即試驗(yàn)設(shè)計(jì)中的第一組提取花青素的效果最好。

表2 黑米花青素提取工藝的正交結(jié)果Table 2 Orthogonal test results of anthocyanin extraction technique from black rice

為進(jìn)一步確認(rèn)各試驗(yàn)因素的可信度,對黑米花青素提取的正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析(見表3),以合并誤差進(jìn)行F測驗(yàn)。由表3可知,5個(gè)試驗(yàn)因子對試驗(yàn)結(jié)果的影響均達(dá)到極顯著水平(p<0.01)。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果的方差分析表Table 3 Analysis of variance for the result of orthogonal experiment design

2.3 提取次數(shù)的確定

在乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%,提取時(shí)間為60 min,提取溫度為45 ℃,料液比為1∶7 (g∶mL),提取液pH為1的最優(yōu)工藝條件下進(jìn)行黑米花青素的提取。由表4可知,隨著提取次數(shù)的增加,黑米花青素的相對提取率也逐漸增加,首次提取時(shí),花青素的相對提取率達(dá)到80.03%,提取第二次時(shí)相對提取率增加較大,第三次的時(shí)候增加幅度變小,第四次時(shí)影響已經(jīng)明顯減小,所以從省時(shí)、省料上考慮最佳提取次數(shù)為3次,其花青素的相對總提取率達(dá)到99.29%。

表4 提取次數(shù)研究結(jié)果Table 4 Results of extracting times

2.4 花青素含量和得率

以矢車菊-3-葡萄糖苷為標(biāo)準(zhǔn)品繪制花青素含量測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖6。其標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.0187x-0.0054,R2=0.9981,式中y為吸光光度值,x為矢車菊-3-葡萄糖苷濃度。將正交設(shè)計(jì)的16個(gè)實(shí)驗(yàn)號代入公式計(jì)算發(fā)現(xiàn),實(shí)驗(yàn)1號的首次提取液花青素含量最高,為34.34 μg/mL,其次為實(shí)驗(yàn)15號,為25.46 μg/mL,第三為實(shí)驗(yàn)9號,為24.89 μg/mL,而實(shí)驗(yàn)14號的花青素含量最低,僅為3.19 μg/mL。

圖6 花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6 Standard curve of Anthocyanin

因此,根據(jù)1.2.4花青素得率的計(jì)算公式,采用實(shí)驗(yàn)1號的最佳提取工藝,1 g黑米粉經(jīng)3次提取后,花青素的得率為298.23 μg/g。如果分別采用實(shí)驗(yàn)15、9和14號工藝,1 g黑米粉經(jīng)3次提取后,其花青素得率則分別僅為221.11,216.16和27.70 μg/g,與實(shí)驗(yàn)1號工藝相比,花青素得率大幅下降。

3 討論

黑米花青素是自然界天然花青素的主要來源之一,黑米花青素提取涉及到較多的工藝參數(shù)。Abdel-Aal等[27]證明在其研究的所有有色籽粒中,黑米有最高的花青素含量(3.28 mg/g)。Ekici等[28]在研究花青素提取的溫度、時(shí)間和pH條件時(shí),發(fā)現(xiàn)樣品中的花青素含量在pH3～7的范圍內(nèi)隨pH上升而下降。Kang等[29]在研究黑米花青素提取的優(yōu)化工藝時(shí)也發(fā)現(xiàn)70%(v/v)酸化后的乙醇有最高的花青素提取濃度461.72 mg/L,說明提取液的pH影響花青素的得率。Loypimai等[30]研究來自黑米糠的花青素穩(wěn)定性時(shí)也發(fā)現(xiàn)高溫和高pH將導(dǎo)致花青素的降解。本試驗(yàn)在以無水乙醇為提取溶劑時(shí),發(fā)現(xiàn)影響黑米花青素得率的主要因素是pH,然后依次為提取時(shí)間,液料比,乙醇體積分?jǐn)?shù)和溫度,再次證明控制提取液pH對花青素得率的重要性。

提取溶劑對黑米花青素的提取工藝有較大影響。He等[31]用水為提取溶劑研究大規(guī)模提取黑米花青素工藝時(shí)發(fā)現(xiàn),料液比1∶12,提取溫度為50 ℃,提取時(shí)間為80 min,提取液pH為3.2時(shí)效果最佳。郭梅等[17]以黑米為原料,利用乙醇為浸提劑,研究黑米色素的提取工藝,其最佳工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)95%,料液比1∶45 (g∶mL),浸提pH3.0,浸提溫度80 ℃,浸提時(shí)間90 min;提取pH和溫度均較高,提取時(shí)間較長。Pedro等[20]用乙醇和1.0 mol/L的檸檬酸以80∶20的比例組成的混合液為溶劑,研究黑米花青素的最佳提取工藝后認(rèn)為提取溫度為34.7 ℃,提取時(shí)間為80 min,料液比為1∶30,花青素得率為1.17 mg/g,但該研究沒有考查pH。

本試驗(yàn)確定以乙醇為溶劑提取黑米花青素的最佳工藝條件為:乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%,提取時(shí)間為60 min,提取溫度為45 ℃,料液比為1∶7 (g∶mL),提取液pH為1;其黑米首次提取液花青素含量可達(dá)34.34 μg/mL。該工藝的提取溫度及料液比與侯召華等[9]、張福娣等[32]及鐘巖等[1]相近,但提取溫度更低,液料比更小,有利于節(jié)省藥品以及降低花青素的損失;提取液pH與鐘巖等[1]的試驗(yàn)結(jié)果相同,均為1,由于pH<2時(shí),花青素主要以2-苯基苯并吡喃陽離子的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定存在,所以本試驗(yàn)所用pH為花青素的穩(wěn)定提供了一定的保障。因此,黑米花青素提取的關(guān)鍵控制因素是提取液pH。針對不同的提取溶劑,優(yōu)化黑米花青素的提取工藝,將有利于黑米花青素的工業(yè)化生產(chǎn),提高黑米的附加值,擴(kuò)大水稻產(chǎn)業(yè)發(fā)展路徑。

4 結(jié)論

本研究通過單因素和正交設(shè)計(jì)綜合分析后認(rèn)為黑米花青素的優(yōu)化工藝為:乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%,提取時(shí)間為60 min,提取溫度為45 ℃,料液比為1∶7 (g∶mL),提取液pH為1;該工藝的黑米首次提取液的花青素含量可達(dá)34.34 μg/mL。最佳提取次數(shù)為3次,其花青素相對總提取率達(dá)到99.29%,花青素得率為298.23 μg/g。該工藝的提取溫度更低,液料比更小,從而更節(jié)省藥品和被破壞的花青素更少。通過文獻(xiàn)對比后認(rèn)為黑米花青素提取的關(guān)鍵控制因素是提取液pH。