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(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150030; 2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150030; 3.黑龍江國際旅行衛(wèi)生保健中心,黑龍江哈爾濱150090; 4.哈爾濱海關(guān),黑龍江哈爾濱 150028)

桑葚是桑屬植物,它是溫帶、暖溫帶常見植物,成熟的桑葚營養(yǎng)價值豐富,含有豐富的活性蛋白、維生素、氨基酸、超氧化物歧化酶、白藜蘆醇和花青素等備受人們的喜愛[1],其中花青素是水溶性的天然色素,屬于黃酮類化合物[2],在植物細胞液中多數(shù)以糖苷鍵形成花色苷而存在,其基本結(jié)構(gòu)單元是C6-C3-C6骨架構(gòu)成的2-苯基苯并吡喃[3],結(jié)構(gòu)如圖1所示。由于苯環(huán)上取代基不同形成了近600多種的花色苷,使植物呈現(xiàn)不同的顏色。雖然自然界中花色苷的種類繁多,但存在于植物中的花色苷單體主要有:天竺葵色素、飛燕草色素、矢車菊色素、牽牛花色素、芍藥色素和錦葵色素[4],因其獨特的結(jié)構(gòu),使其具有抗氧化活性可清除體內(nèi)自由基[5]、抗菌消炎[6]、抗腫瘤[7]、保護心腦血管[8]以及緩解視疲勞[9]等功效,現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于食品、藥品、化妝品等領(lǐng)域,具有廣闊的應(yīng)用前景。因此,如何高效地從桑葚中提取花色苷已經(jīng)成為科研工作者研究的熱點。

圖1 花色苷的基本結(jié)構(gòu)Fig.1 Basic structure of anthocyanins

目前,桑葚花色苷提取主要采用傳統(tǒng)熱回流提取,該方法萃取得率低,效率低,溶劑消耗量大,在萃取后期,萃取液溫度過高會引起熱敏性成分發(fā)生大量降解[10]?，F(xiàn)有一些新型的提取技術(shù)用于輔助提取桑葚花色苷,如超聲波輔助提取和微波輔助提取技術(shù),這些新技術(shù)可以有效改善花色苷的提取效率,但是這兩種技術(shù)在提取過程中均會引起萃取液溫度的升高,局部高溫引起花色苷降解的問題無法避免,不適用于熱敏性成分的提取。近年來超高壓提取技術(shù)(High Hydrostatic Pressure,HHP)越來越多的被應(yīng)用到各種食品加工過程中。超高壓提取技術(shù)的機理一方面是超高壓能夠引起帶電基團的去質(zhì)子化,破壞離子鍵和疏水鍵,從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性和構(gòu)象發(fā)生改變,使桑葚細胞內(nèi)的花色苷更容易從細胞內(nèi)擴散到周圍溶劑[11]。另一方面細胞膜的通透性增加,根據(jù)相變理論,隨著壓力增加細胞內(nèi)花色苷的溶解度隨之增加[12],因此,超高壓處理加快了傳質(zhì)過程,從而有效地提高了花色苷的提取率。對比傳統(tǒng)的提取技術(shù),超高壓提取技術(shù)具有提取時間短、提取效率高、雜質(zhì)少,節(jié)能安全等特點[13]。因此,超高壓提取技術(shù)被廣泛應(yīng)用于藍靛果抗氧化物提取[14]、植物多糖提取[15]、茶多酚的提取[16]以及中草藥提取[17]。但采用超高壓提取技術(shù)從桑葚中提取花色苷的工藝以及提取后花色苷單體的種類和含量的研究報道較少。

因此,本文主要從以下兩方面開展研究工作:探究壓力、保壓時間、料液比、乙醇濃度等因素對桑葚花色苷得率的影響,采用響應(yīng)面方法優(yōu)化提取工藝參數(shù);采用高效液相色譜(High performance liquid chromatography,HPLC)鑒定桑葚花色苷提取液中花色苷的組分,為桑葚花色苷的深度開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

桑葚 哈爾濱大潤發(fā)超市,挑選成熟度一致,顏色鮮艷的桑葚,經(jīng)除雜清洗置于-18 ℃冰箱中凍藏備用;甲酸、乙腈、甲醇、乙醇 均為色譜純,美國Fisher公司;超純水(過0.22 μm濾膜)、鹽酸(分析純) 成都市科龍化工試劑場;香草醛、濃鹽酸 天津市富宇精細化工有限公司;飛燕草色素標準品(純度≥97%)、牽?；ㄉ貥藴势?純度≥99%)、芍藥色素標準品(純度≥98%)、矢車菊色素標準品(純度≥98%) 美國Chromadex公司;矢車菊素-3-O-葡萄糖苷標準品(純度≥95%) 美國諾威公司。

HPP600 MPa/30 L超高壓處理裝置 包頭科發(fā)高壓科技有限公司;LAMBDA35型紫外分光光度計 美國Perkin Elmer公司;DK-98-IIA型恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司;RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;SHZ-D(Ⅲ)型循環(huán)水式真空泵 鞏義儀器有限責(zé)任公司;DRYER真空冷凍干燥器 德國西門子公司;安捷倫1100高效液相色譜儀(HPLC) 美國安捷倫有限公司;FZ102微型植物粉粹機 德州潤昕實驗儀器有限公司植物粉碎機;JYL-Y910九陽打漿機 九陽股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 材料預(yù)處理 在實驗前,從冰箱中取出桑葚,解凍后打漿,將漿液置于-20 ℃冷凍干燥機干燥48 h,然后用植物粉碎機進行粉碎,過40目篩,制成桑葚果粉,避光密封保存在4 ℃冰箱中備用。

1.2.2 桑葚花色苷超高壓提取 準確稱取2.00 g桑葚果粉置于真空包裝袋中,按照不同料液比加入不同濃度的乙醇提取液,使其充分混合,封口,將其放入超高壓設(shè)備中進行提取,設(shè)備中的壓力迅速升高一定時間后瞬間降壓,樣品溫度固定在30 ℃保持不變,提取結(jié)束后,然后將萃取液置于離心機中以4000 r·min-1離心15 min后,將上清液用相同質(zhì)量分數(shù)的乙醇定容到100 mL的容量瓶中,計算出不同提取條件下花色苷的得率。

1.2.3 單因素實驗設(shè)計

1.2.3.1 提取壓力對桑葚花色苷得率的影響 桑葚粉質(zhì)量為2.00 g,保壓時間為6 min,料液比為1∶30 g/mL,乙醇濃度為60%,提取壓力分別為100、200、300、400、500 MPa的條件下進行超高壓萃取。

1.2.3.2 保壓時間對桑葚花色苷得率的影響 桑葚粉質(zhì)量為2.00 g,提取壓力為300 MPa,料液比為1∶30 g/mL,乙醇濃度為60%,保壓時間分別為2、4、6、8、10 min的條件下進行超高壓萃取。

1.2.3.3 料液比對桑葚花色苷得率的影響 桑葚粉質(zhì)量為2.00 g,提取壓力為300 MPa,保壓時間為6 min,乙醇濃度為60%,料液比分別為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 g/mL的條件下進行超高壓萃取。

1.2.3.4 提取溶劑乙醇濃度對桑葚花色苷得率的影響 桑葚粉質(zhì)量為2.00 g,提取壓力為300 MPa,保壓時間為6 min,料液比為1∶30 g/mL,乙醇濃度分別為40%、50%、60%、70%、80%的條件下進行超高壓萃取。

1.2.4 響應(yīng)面試驗設(shè)計 在單因素實驗的基礎(chǔ)上,以提取壓力、保壓時間、料液比和乙醇濃度為實驗因素,以花色苷得率為響應(yīng)值。根據(jù)Box-Behnken實驗設(shè)計,優(yōu)化出超高壓提取桑葚花色苷的工藝參數(shù)。各因素水平及其編碼如表1所示。

表1 實驗設(shè)計因素水平及編碼表Table 1 Level of experimental design factors and coding table

采用響應(yīng)面分析法得到的二次回歸模型如下:

式(1)

式(1)中,b0為截距回歸系數(shù);bi為線性回歸系數(shù);bij為交互項回歸系數(shù);Xi,Xj為自變量。

1.2.5 超聲波輔助提取和熱回流提取桑葚中的花色苷 超聲波輔助提取[18]:稱取2.00 g桑葚粉末置于100 mL萃取容器中,按照料液比為1∶20,加入85%乙醇將其溶解,然后將萃取容器密封置于超聲設(shè)備中,設(shè)定超聲功率為430 W,超聲時間為20 min,提取結(jié)束后,余下操作同步驟1.2.2。

熱回流提取[19]:稱取2.00 g桑葚粉末置于200 mL萃取容器中,按照料液比為1∶10 g/mL,加入酸化的乙醇作提取劑,設(shè)定提取溫度為70 ℃,提取時間為2 h,提取結(jié)束后,余下操作同步驟1.2.2。將以上兩種提取方法得到的花色苷提取得率與超高壓提取進行比較。

1.2.6 桑葚花色苷得率的測定 在50 mL的燒杯中,用1%鹽酸-甲醇溶液溶解0.01 g矢車菊素-3-O-葡萄糖苷標準品,制成質(zhì)量濃度為1 g/L的標準溶液。采用pH示差法測定桑葚花色苷得率,其方程如式(2)[20]所示:

Y={[(A520 nm-A700 nm)pH1.0-(A520 nm-A700 nm)pH4.5]×Mw×DF×V×1000}/(Ma×L×m)

式(2)

式(2)中，Y為樣品中花色苷得率，mg/g；A為樣品提取液的吸光值；DF為稀釋倍數(shù)；Mw為矢車菊素-3-葡萄糖苷的相對分子質(zhì)量(449.2)；Ma為矢車菊素-3-葡萄糖苷的消光系數(shù)(26900)；L為比色皿光程，cm；V為總體積，mL；m為樣品質(zhì)量，g。

1.2.7 HPLC法分析桑葚花色苷組成成分

1.2.7.1 花色苷水解 按照NY/T 2640-2014《植物源性食品中花青素的測定》中的HPLC法[21],取最優(yōu)超高壓提取條件下獲得的桑葚提取液,加入1 mL濃鹽酸,避光,在50 ℃條件下水浴1 h,取出冷卻后,用提取液定容至25 mL,經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾后用于HPLC分析。

1.2.7.2 花色苷單體標準樣的制備 分別精確稱取5種桑葚花色苷標準品1 mg,用1%鹽酸-甲醇溶液1 mL溶劑使其溶解,然后分別配制成1 mg/mL的母液,取適量花色苷標準品母液進行混合,再用1%鹽酸-甲醇溶液依次稀釋成200、100、50、25、12.5、6.25、3.125 μg/mL測試溶液。以標準品質(zhì)量濃度X為橫坐標,峰面積Y為縱坐標,繪制標準曲線。

1.2.7.3 色譜條件 色譜柱為Waters C18色譜柱(4.6 mm×250.0 mm,5.0 μm),流動相A為1%甲酸水溶液,流動相B為1%甲酸-乙腈溶液,流速為0.80 mL/min,梯度洗脫程序見表2。進樣量20 μL,柱溫35 ℃,檢測波長530 nm。

表2 流動相梯度洗脫條件Table 2 Gradient elution conditions for mobile phase

1.4 數(shù)據(jù)處理

對每一組數(shù)據(jù)用SPSS 19.0(SPSS,Inc.,Chicago,US)進行方差分析(ANOVA);采用SAS 8.0(SAS Institute Inc.,NC,USA)分析提取因素水平對花色苷提取效果的顯著差異;Design Expert 8.0(SAT-EASE,Inc.,Last September,UK)軟件設(shè)計組合實驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素對桑葚花色苷提取效果的影響

2.1.1 提取壓力對桑葚花色苷提取效果的影響 由圖2可知,當提取壓力在100～300 MPa時,桑葚花色苷得率隨提取壓力的增大而顯著增加(p<0.05)。其原因一方面是由于高壓能破壞離子鍵和疏水鍵,使細胞膜上的結(jié)構(gòu)蛋白和構(gòu)象發(fā)生改變,導(dǎo)致細胞膜的通透性增加,進而能有效促進細胞內(nèi)溶物流出[22]。此外,隨著壓力的增加細胞能的活性成分的溶解度也隨之增加,因此,高壓處理能加快傳質(zhì)過程,壓力越高越多的活性成分被提取,故升高壓力可以提高桑葚花色苷得率。當提取壓力在300～500 MPa時,隨壓力的增大,花色苷的得率基本保持不變,這可能是由于花色苷已經(jīng)充分溶出且在提取溶劑內(nèi)溶解已經(jīng)達到飽和,故增大壓力花色苷的得率基本保持不變[23]。過高的壓力不僅給提取設(shè)備增加負擔,也會增加提取成分,綜合考慮提取壓力選擇在200～400 MPa較佳。

圖2 壓力對花色苷得率的影響Fig.2 Effect of pressure on the yield of anthocyanins注:不同字母表示差異顯著(p<0.05),圖3～圖5同。

2.1.2 保壓時間對桑葚花色苷提取效果的影響 由圖3可知,當保壓時間在2～6 min時,桑葚花色苷得率隨保壓時間的增大而顯著增加(p<0.05),在6 min時,花色苷得率達到最大4.35 mg/g。其原因是由于從保壓時間的延長,細胞內(nèi)的花色苷大量地從細胞內(nèi)擴散到周圍溶劑中,使得花色苷得率顯著升高(p<0.05)。在6 min以后,進一步延長保壓時間花色苷的得率保持不變?？赡苁怯捎谔崛∪軇┲谢ㄉ諠舛扰c桑葚細胞內(nèi)花色苷一致,內(nèi)外濃度差趨近于零,即溶劑中花色苷達到飽和狀態(tài)。因此,進一步延長保壓時間,花色苷得率基本保持不變。綜合考慮,保壓時間選擇在4～8 min較佳。

圖3 保壓時間對花色苷得率的影響Fig.3 Effect of pressure-holding time on the yield of anthocyanins

2.1.3 料液比對桑葚花色苷提取效果的影響 由圖4可知,隨料液比的增加,花色苷得率呈現(xiàn)先顯著增大后顯著降低的趨勢(p<0.05)。當料液比1∶30 g/mL時,花色苷的得率達到最大值4.21 mg/g。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是隨著料液比的增加,固液接觸面積和濃度梯度增加,有利于桑葚細胞內(nèi)的花色苷由內(nèi)向外擴散,使得花色苷得率增加[24]。當料液比繼續(xù)增加,醇溶性的雜質(zhì)溶解度增加,雜質(zhì)與花色苷競爭乙醇,使花色苷的溶解被抑制[25]。同時較高的料液比對后續(xù)花色苷的分離純化造成困難。因此,較高的料液比不利于花色苷的提取。綜合考慮,料液比選擇在1∶20～1∶40 g/mL較佳。

圖4 料液比對花色苷得率的影響Fig.4 Effect of solid-to-liquid ratio on the yield of anthocyanins

2.1.4 乙醇濃度對桑葚花色苷提取效果的影響 由圖5可知,桑葚花色苷得率隨乙醇濃度的增加呈現(xiàn)先顯著增大后顯著減小的趨勢(p<0.05)。乙醇濃度在60%時,花色苷得率達到最大值4.21 mg/g。其原因是隨乙醇濃度的增加,溶劑的溶解解能力增強,促進花色苷溶解,因此花色苷得率隨乙醇濃度增大而升高。在乙醇濃度為60%時,其極性與花色苷極性相似,根據(jù)相似相容原理,此時花色苷得率最高[26]。當乙醇濃度高于60%,一方面醇溶性的雜質(zhì)、色素和親脂性強的成分溶出量增加,其成分與花色苷競爭乙醇-水分子,使得花色苷溶出量降低,進而導(dǎo)致花色苷得率降低[27];另一方面,高濃度的乙醇破壞花色苷-蛋白質(zhì)和花色苷-纖維素之前的氫鍵和疏水鍵[28],破壞花色苷結(jié)構(gòu)。此外,由于極性差距逐漸增大,花色苷溶解度降低,擴散系數(shù)減小,故花色苷得率降低[25]。綜合考慮,乙醇濃度選擇在50%～70%較佳。

圖5 乙醇濃度對花色苷得率的影響Fig.5 Effect of ethanol concentration on the yield of anthocyanins

2.2 響應(yīng)曲面法實驗結(jié)果及方差分析

2.2.1 模型建立與顯著性檢驗 依據(jù)單因素實驗結(jié)果,選取對桑葚花色苷得率影響顯著的4個因素即壓力(X1)、保壓時間(X2)、料液比(X3)和乙醇濃度(X4),根據(jù)Box-Behnken實驗設(shè)計了組合實驗對提取工藝進行優(yōu)化,實驗結(jié)果如表3所示。運用Design Expert 8.0軟件對表3的實驗數(shù)據(jù)進行回歸分析,得到桑葚花色苷得率(Y)指標的回歸數(shù)學(xué)模型,剔除不顯著項,其回歸方程如式(3)所示:

表3 響應(yīng)曲面法實驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 Experimental design and results of response surface methodology

式(3)

對上述的回歸方程進行方差分析,結(jié)果見表4。

由表3可知,極顯著因素為X2,顯著因素為X1、X4、X22、X32、X1X2、X2X4,其余因素均不顯著。因素對桑葚花色苷提取率影響的主次順序為X2>X1>X4>X3。結(jié)果表明實驗因素對響應(yīng)值不是簡單的線性關(guān)系,模型中(p<0.001),多元回歸關(guān)系極顯著,相關(guān)系數(shù)R2=0.8406、模型的變異系數(shù)CV=0.1354,失擬項為0.0769(p>0.05),失擬項不顯著,說明方程擬合充分,回歸方程高度顯著,可以較好地描述各因素與響應(yīng)值之間的真實關(guān)系,利用該回歸方程可以優(yōu)化桑葚花色苷最佳提取工藝參數(shù)。

2.2.2 桑葚花色苷得率的響應(yīng)面分析 依據(jù)響應(yīng)曲面得到的回歸方程,建立桑葚花色苷得率與實驗因素的三維空間的曲面圖,確定最佳花色苷得率提取條件。等高線的形狀可以反映出交互作用對響應(yīng)值影響的強弱，如果是橢圓形表明影響顯著，如果為圓形表明影響不顯著。二次回歸方程的響應(yīng)面及其等高線如圖6和圖7所示。

圖7 乙醇濃度和保壓時間對花色苷得率的響應(yīng)面分析Fig.7 Response surface analysis for the effect of pressure-holding time and ethanol concentration on the yield of anthocyanins

由圖6可知，提取壓力與保壓時間對桑葚花色苷得率的影響較大，曲面陡峭，存在極值，等高線密集，說明兩因素的交互作用對該響應(yīng)值有顯著性影響(p<0.05)；由圖7可知，乙醇濃度與保壓時間對桑葚花色苷得率影響的響應(yīng)面圖曲線陡峭，等高線呈橢圓，說明兩因素的交互作用對桑葚花色苷得率的影響顯著(p<0.05)。

2.2.3 最佳工藝條件及驗證 通過Design Expert軟件對式(3)的回歸方程分析,得到最佳提取條件:壓力269.76 MPa、保壓時間6.17 min、料液比1∶35.39 g/mL、乙醇濃度62.16%,桑葚花色苷得率的理論值(4.93±0.12) mg/g,為了驗證該方法的可靠性,考慮實際情況,將最佳工藝參數(shù)修正為:壓力270 MPa、萃取時間6 min、料液比1∶35、乙醇濃度62%,在此條件下進行花色苷得率的驗證實驗,實驗重復(fù)3次,平均值為4.81 mg/g,理論值和實驗值相對誤差為2.43%。說明模型可以較好地模擬和預(yù)測桑葚花色苷得率且優(yōu)化結(jié)果具有可行性。

2.3 超高壓、熱回流、超聲波輔助提取三種提取方法對桑葚花色苷效果的比較

由圖8可知,超高壓提取時間為6 min,花色苷的得率為4.82 mg/g。最優(yōu)超聲波提取條件下,提取時間為20 min,花色苷的得率為3.94 mg/g。最優(yōu)熱回流提取條件下,提取時間為2 h,花色苷的得率為3.57 mg/g。將超高壓提取與超聲波提取對比發(fā)現(xiàn),前者花色苷的得率提高了18.26%,時間縮短了1.5倍。將超高壓提取與熱回流提取對比發(fā)現(xiàn),前者花色苷的得率提高了25.93%,時間縮短了4倍。超高壓提取能顯著提高提取溶劑的滲透速率和活性成分的傳質(zhì)效率,可以在低溫下操作,能有效避免熱敏性成分因受熱而失活,從提取時間、得率方面優(yōu)于超聲波提取和熱回流提取。因此,超高壓提取技術(shù)適合桑葚花色苷的提取。

圖8 不同提取方式對花色苷得率的影響Fig.8 Effect of different extraction methods on the yield of anthocyanins

2.4 花色苷提取液的HPLC組分分析

在最優(yōu)工藝條件下獲得的桑葚花色苷的粗提液和4種花色苷單體標準品進行HPLC分析,進一步分析桑葚花色苷單體種類和含量,色譜圖如圖9所示。分別將4種花色苷單體標準品的質(zhì)量濃度X與峰面積Y用Sigmaplot軟件進行線性回歸分析,得到如表5中的標準方程。

表5 5種花色苷標準品曲線、相關(guān)系數(shù)、線性范圍Table 5 Standard curves,correlation coefficients and linear ranges for five anthocyanin standards

圖9 4種花色苷單體標準品(a)和桑葚提取液(b)HPLC色譜圖Fig.9 Chromatogram of 4 anthocyanin monomer standard(a)and mulberry extracts(b)HPLC

將超高壓最優(yōu)工藝條件下得到的桑葚提取液的色譜圖與與標準品色譜圖進行比對,并且依據(jù)表5中標準品擬合方程,可以定性和定量獲得花色苷每個單體含量,其結(jié)果如表6所示。

表6 桑葚花色苷出峰時間、質(zhì)量濃度、含量和比例Table 6 Peak time,mass concentration,and total and individual contents of anthocyanins in mulberry

由圖9和表5的出峰時間可以判斷,圖9b中桑葚花色苷粗提液樣品出現(xiàn)4個峰,峰形良好,無雜峰,出峰順序依次均為飛燕草色素、矢車菊色素、牽?；ㄉ亍⑸炙幧?。超高壓最優(yōu)工藝條件下對應(yīng)花色苷單體含量分別為1.32、2.05、0.27、0.25 mg/g,花青素總含量為3.89 mg/g。由實驗結(jié)果可知,桑葚中包含4種花色苷單體,矢車菊色素含量最高,占52.70%,其次是飛燕草色素,占33.93%,牽牛花色素和芍藥色素含量差別不大,分別占總花色苷含量的6.94%和6.43%。

3 結(jié)論

通過單因素實驗,采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化超高壓提取桑葚花色苷的工藝,建立了四因素對花色苷得率的二次回歸模型,經(jīng)驗證模型可靠,可用于預(yù)測不同提取條件下桑葚花色苷的提取率。根據(jù)模型確定最佳的工藝參數(shù)為:壓力270 MPa、萃取時間6 min、料液比1∶35、乙醇濃度62%,在此條件下桑葚花色苷提取得率為(4.93±0.12) mg/g,較熱回流提取和超聲波提取得率分別提高了25.93%和18.26%。通過HPLC鑒定出桑葚花色苷包含4種花色苷單體分別為飛燕草色素、矢車菊色素、牽?；ㄉ?、芍藥色素,其含量分別為1.32、2.05、0.27、0.25 mg/g。超高壓提取技術(shù)具有效率高、提取時間短、有效避免熱敏性成分因受熱而導(dǎo)致的降解和失活,可為桑葚花色苷提取新工藝提供理論依據(jù)。