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(河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院,河北石家莊 050000)

隨著生活水平的不斷提高,人們對(duì)食品添加劑中的防腐劑提出了更高的要求,不僅希望其防腐效果明顯,同時(shí)希望其更加安全無(wú)毒害,因此使用天然防腐劑代替化學(xué)合成防腐劑已成為發(fā)展趨勢(shì)。研究發(fā)現(xiàn),精油是天然抗菌劑,具有廣譜的抑菌活性,對(duì)有細(xì)胞壁和無(wú)細(xì)胞壁的革蘭氏陽(yáng)性、陰性菌均有抑制作用[1]。唐裕芳等[2]發(fā)現(xiàn),蒼術(shù)揮發(fā)油對(duì)3種細(xì)菌(大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌)、4種真菌(酵母、青霉、黑曲霉、黃曲霉)均具有良好的抑制作用,且與濃度呈依賴關(guān)系;張有林等[3]發(fā)現(xiàn),百里香精油對(duì)細(xì)菌的抗菌性均表現(xiàn)為敏感型;干信等[4]也發(fā)現(xiàn),花椒揮發(fā)油也具有良好的抑菌效果,不僅能抑制革蘭氏陰性菌,也能抑制革蘭氏陽(yáng)性菌。

姜黃油為姜科植物姜黃(CurcumalongaL.)的塊狀根莖經(jīng)水蒸氣蒸餾得到的揮發(fā)油,所含成分極其復(fù)雜,一般有數(shù)十種至數(shù)百種組分[5]。主要為萜類化合物、芳香族化合物,如姜黃烯、倍半萜烯、姜黃酮等物質(zhì)[6]。姜黃油具有抑菌、抗氧化、抗癌、抗炎、止咳等功能[7-8]。研究表明,植物精油的抑菌機(jī)理是精油及成分作用到微生物的細(xì)胞膜,當(dāng)微生物的膜結(jié)構(gòu)受損,微生物的膜透氣性增加,從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)部離子和內(nèi)含物發(fā)生外泄或微生物的酶系統(tǒng)受到損傷,從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡[9-12]。Lv、Yang等[13-14]研究也證明了這一點(diǎn)。胡小軍、吳斌、Charoenkul等[15-17]對(duì)姜黃油的抑菌活性進(jìn)行了研究,但并沒(méi)有對(duì)其抑菌機(jī)理進(jìn)行進(jìn)一步的分析。

本文主要研究了姜黃油對(duì)枯草芽孢桿菌、蠟樣芽胞桿菌、藤黃八疊球菌和沙門氏菌四種供試菌的抑菌活性,并對(duì)其抑菌機(jī)理進(jìn)行了初步的探究,為開(kāi)發(fā)姜黃油的生物學(xué)活性提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

姜黃根莖 由河北澤華生物科技有限公司提供，自然晾曬干燥，至其中水分含量為10%后，用粉碎機(jī)打碎，過(guò)40目篩，得到姜黃粉，使用前放置在80 ℃左右干燥箱中烘干，至水分含量低于0.5%，放于干燥器中備用;革蘭氏陽(yáng)性菌:枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、蠟樣芽胞桿菌(Bacilluscereus)、藤黃八疊球菌(Sarcineluted.),革蘭氏陰性菌:沙門氏菌(Salmonella) 均由河北科技大學(xué)食品科學(xué)系提供;姜黃 2014年產(chǎn)于印度卡納塔克邦;無(wú)水乙醇(分析純) 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所;叔丁醇、戊二醛 天津博迪化工股份有限公司;葡萄糖 天津百世化工有限公司;吐溫80 天津市永大試劑有限公司;考馬斯亮藍(lán)、DNS試劑 上海寶曼生物科技有限公司;磷酸緩沖溶液(PBS,pH=7.0) 石家莊茂財(cái)生物科技有限公司。

S-4800-1場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡 日本HITACHI;Adventurer分析電子天平 美國(guó)奧豪斯儀器有限公司;EPOCH2全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀 美國(guó)博騰儀器有限公司;D-1-70型自動(dòng)控制壓力蒸汽滅菌鍋 北京發(fā)恩科貿(mào)有限公司;打孔器、電導(dǎo)儀 上海雷磁新涇儀器有限公司;KQ5200DE數(shù)控超聲清洗器 昆山市起生儀器有限公司;7HZ-82A水浴恒溫振蕩器 常州榮華儀器制造有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 姜黃油及培養(yǎng)基的制備 姜黃油的制備:通過(guò)離子液體[BMIM]PF6酶法輔助提取姜黃油,其中離子液體添加量為18%,纖維素酶添加量為1.4%,液料比為10∶1,酶解溫度為50 ℃,酶解時(shí)間90 min。提取得到的姜黃油為橙黃色透明液體,具有典型的姜黃氣味[18]。

姜黃油儲(chǔ)備液的制備:配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.002%的吐溫80溶液,稀釋姜黃精油至體積分?jǐn)?shù)為50 μL/mL,4 ℃貯藏備用。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的制備:牛肉膏3 g,蛋白胨10 g,氯化鈉5 g,定容到1000 mL,調(diào)節(jié)pH在7.4～7.6之間。其中固體培養(yǎng)基補(bǔ)加15～20 g的瓊脂。

1.2.2 抑菌圈(DIZ)的測(cè)定 參考Sharma等[19]的方法,采用打孔法測(cè)定DIZ大小。向培養(yǎng)皿(90 mm)中倒入20 mL已滅菌的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基,冷卻,待其凝固后,分別加入100 μL的枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、藤黃八疊球菌、沙門氏菌4種菌液(濃度調(diào)整為1×107cfu/mL),均勻涂布,靜置5 min。用打孔器在培養(yǎng)基等位置處,打成直徑5 mm的三個(gè)圓孔,其中兩個(gè)孔加入10 μL的姜黃油,另一個(gè)孔加入0.002%吐溫80作為陰性對(duì)照。靜置5 min,37 ℃培養(yǎng)12 h后,用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈大小。

抑菌圈(mm)=藥品組抑菌圈-陰性對(duì)照組抑菌圈

1.2.3 最低抑菌濃度(MIC)的測(cè)定 以0.002%的吐溫80生理鹽水為對(duì)照組溶劑,采用二倍稀釋法,將姜黃油按不同的濃度梯度稀釋,使其在培養(yǎng)基中的終濃度分別為0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4、12.8、25.6 μL/mL,以相同質(zhì)量濃度的吐溫80做陰性對(duì)照,分別將4種菌體溶度調(diào)整為1×107cfu/mL后,接種于培養(yǎng)基中,于37 ℃培養(yǎng)12 h,測(cè)定其OD600。當(dāng)吸光度沒(méi)有明顯變化時(shí)對(duì)應(yīng)的姜黃油濃度記為MIC。

1.2.4 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 對(duì)照生長(zhǎng)曲線:將枯草芽孢桿菌、和蠟樣芽胞桿菌、藤黃八疊球菌和沙門氏菌稀釋成1×107cfu/mL后，于37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng),培養(yǎng)期間每隔1 h取樣,用酶標(biāo)儀在600 nm處測(cè)其OD值,記錄數(shù)據(jù)。

樣品組生長(zhǎng)曲線:將1×107cfu/mL的4種供試菌菌液,加入到含0、0.5、0.75 MIC濃度的姜黃油培養(yǎng)基中培養(yǎng),培養(yǎng)期間每隔1 h取樣,用酶標(biāo)儀在600 nm處測(cè)光密度值(OD值),記錄數(shù)據(jù)。

1.2.5 菌體形態(tài)的測(cè)定 參考馮雅靜[20]的方法并進(jìn)行修改。將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的枯草芽孢桿菌和沙門氏菌加入到含0、1 MIC姜黃油的培養(yǎng)基中,使菌種濃度為1×107cfu/mL,搖床培養(yǎng)(37 ℃,200 r/min),在4 h分別取樣5 mL,4500 r/min離心10 min,收集菌體沉淀,PBS洗滌3次。加入適量的戊二醛于4 ℃環(huán)境中放置4 h,然后采用30%、50%、70%、90%乙醇及無(wú)水乙醇(每次離心10 min)進(jìn)行梯度洗脫,最后加入2.5%叔丁醇置換出乙醇,將處理好的樣品平鋪于滅菌的培養(yǎng)皿中,放于超凈臺(tái)上自然風(fēng)干,后鍍膜進(jìn)行電鏡觀察。

1.2.6 電導(dǎo)率的測(cè)定 參考Diao等[21]的方法。將4種供試菌接種于液體培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)12 h,4000 r/min離心10 min,棄上清液,用5%葡萄糖溶液洗至菌液的相對(duì)電導(dǎo)率與5%葡萄糖溶液的相對(duì)電導(dǎo)率相當(dāng),此菌液作為等滲菌。向5%葡萄糖溶液中分別加入不同濃度的姜黃油(0、1 MIC),混勻,測(cè)其相對(duì)電導(dǎo)率記為L(zhǎng)1。取等滲菌液分別加入不同濃度的姜黃油(0、1 MIC),37 ℃下培養(yǎng) 6 h,每1 h取出測(cè)定相對(duì)電導(dǎo)率,記為L(zhǎng)2。將懸于5%葡萄糖溶液的菌液沸水浴5 min 冷卻后,測(cè)定相對(duì)電導(dǎo)率記為L(zhǎng)0。菌種膜通透性的相對(duì)電導(dǎo)率根據(jù)如下公式計(jì)算。

相對(duì)電導(dǎo)率(%)=(L2-L1)/L0×100%

1.2.7 姜黃油對(duì)細(xì)胞內(nèi)容物滲漏的影響 菌體活化后用PBS清洗3次,重懸于PBS中,混勻。將混勻的菌懸液分成2等份,加入不同濃度的姜黃油,使姜黃油在菌懸液中的終濃度分別為0、1 MIC。混勻后,將菌懸液置于37 ℃,200 r/min培養(yǎng)3 h,5000 r/min離心 15 min。取離心后的上清液0.2 mL,用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在260 nm下測(cè)定吸光值(用PBS作空白調(diào)零)。再取離心后的上清液0.5 mL,加入5 mL 的考馬斯亮藍(lán)試劑,5 min后,調(diào)分光光度計(jì)波長(zhǎng)至595 nm處,以0.5 mL蒸餾水,5 mL的考馬斯亮藍(lán)試劑管為調(diào)零點(diǎn),測(cè)樣品管的吸光值,通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.0054x+0.0034(R2=0.9993),計(jì)算待測(cè)樣品的蛋白質(zhì)含量[22]。最后取處理好的上清液 0.5 mL,加入1.5 mL的蒸餾水,再加入1.5 mL DNS,搖勻,在沸水浴中準(zhǔn)確加熱10 min,取出,用冷水迅速冷卻至室溫,調(diào)分光光度計(jì)波長(zhǎng)至540 nm,以2 mL蒸餾水+1.5 mL DNS管為調(diào)零點(diǎn),測(cè)定OD值,通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.1461x+0.0624(R2=0.9995),計(jì)算待測(cè)樣品的還原糖含量。以上處理均重復(fù)3次。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

本文中所有實(shí)驗(yàn)均平行3次。所有數(shù)據(jù)均以平均值(mean)±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示。用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA),以p<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 姜黃油抑菌性能的測(cè)定結(jié)果

通過(guò)測(cè)定4種菌的抑菌圈直徑的大小和最低抑菌濃度,判斷其對(duì)姜黃油的敏感程度。DIZ值越大,抑菌效果越好。最低抑菌濃度(MIC)值越小,抑菌效果越好,說(shuō)明在較低的質(zhì)量濃度下,就可以抑制微生物的生長(zhǎng)[23]。由表1可以看出,姜黃油對(duì)4種供試菌均有較好的抑菌效果,其中對(duì)沙門氏菌的抑菌效果最好,其抑菌圈為15.3 mm,MIC值為0.4 μL/mL,其次是枯草芽孢桿菌>蠟樣芽胞桿菌>藤黃八疊球菌。

表1 姜黃油對(duì)4種供試菌的抑菌性能Table 1 Antibacterial activity of turmeric oil to four tested strains

2.2 4種菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定結(jié)果

菌液的OD600值可以用來(lái)衡量菌液中細(xì)菌數(shù)目的多少,因此,OD600值變化可以反映姜黃油對(duì)細(xì)菌的抑制和殺滅作用的大小[24]。圖1為4種細(xì)菌在不同濃度姜黃油作用下所表現(xiàn)的生長(zhǎng)曲線圖。從圖1中可以看出,空白組呈現(xiàn)典型的S型,說(shuō)明細(xì)菌正常生長(zhǎng)狀況良好。當(dāng)添加了不同濃度的姜黃油后生長(zhǎng)曲線變化明顯,OD600值也隨時(shí)間的延長(zhǎng)而升高,但是增加幅度相比空白組明顯減小。姜黃油對(duì)4種供試菌的生長(zhǎng)均有很好的抑制作用,并且其抑制作用與劑量成依賴關(guān)系。姜黃油能夠抑制4種菌體的生長(zhǎng),12 h后生長(zhǎng)處于穩(wěn)定期,細(xì)菌的活性完全被抑制。由此說(shuō)明,姜黃油能減弱供試菌的生長(zhǎng)速度,延緩其生長(zhǎng)期,在穩(wěn)定期時(shí)能抑制多半的細(xì)菌生長(zhǎng)。

圖1 不同濃度姜黃油對(duì)4種供試菌生長(zhǎng)曲線的影響Fig.1 Effects of different concentration of turmeric oil on growth curve of four tested strains

2.3 姜黃油對(duì)兩種代表性菌體形態(tài)的影響

試驗(yàn)選取了其中最具代表性且抑菌效果最好的兩株菌,一個(gè)為革蘭氏陽(yáng)性菌即枯草芽孢桿菌,一個(gè)為革蘭氏陰性菌即沙門氏菌,觀察其在姜黃油處理前后的細(xì)胞形態(tài)變化,掃描電鏡微生物超微結(jié)構(gòu)的觀察結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2A、圖2C可知,當(dāng)枯草芽孢桿菌和沙門氏菌沒(méi)有被姜黃油處理時(shí),菌體形態(tài)兩端鈍圓,呈現(xiàn)典型的短桿狀,大小比較整齊[25]。菌體表面光潔平整,圓潤(rùn)充盈飽滿,細(xì)胞表面沒(méi)有出現(xiàn)損壞也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)流出。經(jīng)過(guò)精油處理4 h后,由圖2B、2D可明顯看出,菌體外部出現(xiàn)損傷,菌體不再充盈圓潤(rùn),表面不再平整,部分細(xì)胞形態(tài)破損嚴(yán)重,已經(jīng)不能呈現(xiàn)完整的菌體形態(tài),同時(shí),能夠看到大量的破碎粘連或凹陷,這也是造成細(xì)胞內(nèi)容物泄露的出口。這些損傷性的變化，可能是由于姜黃油引起了胞膜組分的溶解和轉(zhuǎn)變,導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)形態(tài)學(xué)上的改變,進(jìn)而容易導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物泄露、受損、發(fā)生代謝紊亂和死亡[26]。掃描電鏡圖從形態(tài)學(xué)方面表明了姜黃油的抑菌機(jī)理。

圖2 枯草芽孢桿菌和沙門氏菌的掃描電鏡圖Fig.2 Scanning electron micrographs of Bacillus subtilis and Salmonella注：A：未處理的枯草芽孢桿菌；B：1 MIC處理的枯草芽孢桿菌；C：未處理的沙門氏菌；D：1 MIC處理的沙門氏菌。

2.4 電導(dǎo)率的測(cè)定結(jié)果

細(xì)胞膜是細(xì)菌的一個(gè)屏障,既可以阻擋外源物質(zhì)的進(jìn)入,也可以防止內(nèi)部物質(zhì)的流出[27]。當(dāng)細(xì)胞膜受到損壞,胞內(nèi)物質(zhì)就會(huì)釋放出來(lái),小分子如鉀離子、鈉離子、磷酸根離子等電解質(zhì)外泄至培養(yǎng)液中,使培養(yǎng)液的電導(dǎo)率上升。菌液電導(dǎo)率的變化反映了細(xì)菌細(xì)胞膜通透性的變化[28]。由圖3可以看出,0 MIC姜黃油處理的4種菌的電導(dǎo)率變化不明顯,在開(kāi)始的兩個(gè)小時(shí)電導(dǎo)率呈升高的趨勢(shì),可能是由于正常菌體的細(xì)胞自身溶解和死亡所致[29]。當(dāng)經(jīng)1 MIC姜黃油處理后,枯草芽孢桿菌、蠟樣芽胞桿菌和沙門氏菌這3種供試菌的電導(dǎo)率明顯增長(zhǎng),且在前2 h內(nèi)電導(dǎo)率升高最大。這說(shuō)明在前2 h內(nèi),姜黃油明顯破壞了供試菌的細(xì)胞壁,使其通透性增加,將細(xì)胞內(nèi)離子外泄到細(xì)胞外,致使菌懸液電導(dǎo)率明顯升高。2～10 h處于升高緩慢并逐漸趨于穩(wěn)定的狀態(tài),10 h后處于穩(wěn)定狀態(tài)。藤黃八疊球菌電導(dǎo)率的增長(zhǎng)并不是很明顯,但也有一定的增長(zhǎng)。姜黃油之所以能夠促使供試菌培養(yǎng)基的電導(dǎo)率升高,主要是由于姜黃油能夠作用于菌體的細(xì)胞壁,攻擊細(xì)胞膜,使其細(xì)胞受損,離子穩(wěn)態(tài)失衡,影響菌體的代謝,最終導(dǎo)致菌體死亡[30]。

圖3 不同濃度姜黃油對(duì)4種供試菌電導(dǎo)率的影響Fig.3 Effects of different concentration of turmeric oil on the conductivity of four tested strains

2.5 姜黃油對(duì)細(xì)胞內(nèi)容物滲漏的影響

核酸、蛋白質(zhì)類的大分子物質(zhì)貫穿于整個(gè)胞膜和胞質(zhì)當(dāng)中,是重要的單位結(jié)構(gòu)物質(zhì)。菌體核酸、蛋白質(zhì)等內(nèi)容物質(zhì)的釋放,說(shuō)明細(xì)胞膜完整性遭到了破壞,表明抑菌物質(zhì)對(duì)菌體膜完整性產(chǎn)生了影響,細(xì)胞膜的完整性是菌體正常生長(zhǎng)代謝的一個(gè)主要影響因素。測(cè)定結(jié)果如表2所示,加入1 MIC的姜黃油后,4種供試菌的OD260(核酸)明顯升高,還原糖的含量也明顯升高,蛋白質(zhì)的含量呈倍增長(zhǎng)。此內(nèi)容物釋放趨勢(shì)與Shen等[31]的結(jié)果相同。其中,姜黃油對(duì)沙門氏菌的破壞最嚴(yán)重,其內(nèi)容物質(zhì)泄露最為嚴(yán)重,與其抑菌效果的結(jié)果一致。表明姜黃油導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物的泄漏,影響細(xì)胞的正常生長(zhǎng),從而抑制了細(xì)菌的繁殖,是其抑制菌體生長(zhǎng)的原因之一[31]。

表2 姜黃油對(duì)4種供試菌細(xì)胞內(nèi)容物的影響Table 2 Effects of turmeric oil on cell contents on four tested strains

3 結(jié)論

本文選擇姜黃油做抑菌物質(zhì),研究了姜黃油作用于4種供試菌的抑菌性,得出結(jié)果:姜黃油對(duì)沙門氏菌和枯草芽孢桿菌有很好的抑菌效果,其最低抑菌濃度分別為均為0.4、0.8 μL/mL,抑菌圈大小分別為15.3、12.2 mm。姜黃油對(duì)4種供試菌的生長(zhǎng)均有明顯的抑制作用,培養(yǎng)基中電導(dǎo)率明顯增加。掃描電鏡圖顯示,姜黃油破壞了菌體細(xì)胞的形態(tài),細(xì)胞表面褶皺,胞體扭曲,凹陷;姜黃油影響了菌體胞膜的通透性,小分子物質(zhì)泄漏,離子穩(wěn)態(tài)瓦解;由于姜黃油的作用,細(xì)胞膜完整性遭到破壞,大量核酸、蛋白質(zhì)釋放,菌體生長(zhǎng)繁殖受阻。本實(shí)驗(yàn)為姜黃油作為高效、低成本的抑菌劑更好地應(yīng)用于食品產(chǎn)業(yè)提供了理論依據(jù)。