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(1.賀州學(xué)院食品科學(xué)與工程技術(shù)研究院,廣西賀州 542899;2.大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,遼寧大連 116034)

2002年4月,瑞典研究人員首次在炸薯?xiàng)l、焙烤土豆脆片、面包、谷物、餅干等一些油炸、焙烤的淀粉類食品中檢測(cè)出丙烯酰胺[1]。丙烯酰胺(Acrylamide)是中等毒性的親神經(jīng)毒物,水溶性強(qiáng),很容易被生物體的消化道、皮膚、肌肉或其他途徑吸收,引起急慢性中毒,主要表現(xiàn)為損害神經(jīng)系統(tǒng)[2-3],是潛在致癌物。近年來,丙烯酰胺的危害倍受人們關(guān)注。食品中的丙烯酰胺主要來源于美拉德反應(yīng),天冬酰胺和還原糖是其主要前體物質(zhì)[4],有研究證明,綠茶提取物[5]、竹葉提取物[6]、獼猴桃提取物[7]、油溶性竹葉抗氧化物[8]、水飛薊素提取物和迷迭香提取物[9]等許多具有良好抗氧化活性的天然植物提取物,對(duì)丙烯酰胺的形成均具有良好的抑制作用。

荸薺(Eleocharistuberose),又名馬蹄,其果皮含有豐富的酚類、黃酮類等抗氧化活性物質(zhì)[10-12]?，F(xiàn)有研究表明,從荸薺皮乙酸乙酯萃取部位中分離得到金魚草素[13]、5-甲基金魚草素[14]、5-異戊烯基金魚草素[15]、樺木酸[16]、木犀草素[17]、6-甲基木犀草素[18]等多種具有良好抗氧化活性的物質(zhì)。荸薺皮提取物抗氧化性好,但目前仍未見將其應(yīng)用于食品加工中抑制丙烯酰胺形成方面的研究。本文考察了荸薺皮70%丙酮總提取物、不同極性萃取液在土豆脆片焙烤中對(duì)丙烯酰胺形成抑制效果的影響,并進(jìn)一步探討了正丁醇萃取物經(jīng)大孔樹脂分離純化后的乙醇洗脫液對(duì)丙烯酰胺抑制效果的影響,為尋找優(yōu)良的丙烯酰胺天然抑制劑提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

荸薺皮粉 廣西賀州市芳林鄉(xiāng)所產(chǎn)荸薺,削皮、曬干、粉碎、過60目篩而得;土豆粉 云南麗江紅心土豆,去皮、切片、曬干、打粉、過100目篩,4 ℃下密封冷藏備用;甲醇 優(yōu)級(jí)純,天津科密歐化學(xué)試劑有限公司;丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥99.5%)、D101型大孔樹脂 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所;硫酸鋅 分析純,廣州化學(xué)試劑廠;亞鐵氰化鉀 分析純,天津大茂化學(xué)試劑廠;丙酮、乙酸乙酯、正丁醇、石油醚、乙醇 均為分析純,廣東化工試劑工程技術(shù)研究開發(fā)中心。

R-1020型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 鄭州長城科工貿(mào);LC-2030C 3D型高效液相色譜儀 日本島津制作所;TC-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)型C18柱 美國安捷倫;S228-45202-58型DAD檢測(cè)器 日本島津;Spec:200 mg/3 mL型固相萃取小柱 廣州泛宏;希波式0.45 μm型針筒過濾器 天津富集;LOC-40型離心機(jī) 安微中科中佳;PA2004N型電子天平 上海菁海;10、100、1000、5000 μL型移液槍 賽默飛世爾;HBD-5002型電烤箱 珠海家寶德;ULUP-II-40 L型超純水機(jī) 四川優(yōu)普。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取0.0050 g丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)品,溶解于50.0 mL含5%甲醇的水溶液,制成100 μg/mL丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,再進(jìn)一步稀釋成濃度為10.0、5.0、2.5、1.25、0.625、0.3125 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液,按以下色譜條件進(jìn)行HPLC測(cè)定,以色譜峰面積對(duì)濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到線性回歸方程:y=63032x-1240.3,決定系數(shù)R2=0.9998,線性范圍在0～10 μg/mL之間,相關(guān)性良好。

色譜柱:反相C18柱;流動(dòng)相:水∶甲醇(v∶v,95∶5);進(jìn)樣方式:自動(dòng)進(jìn)樣;進(jìn)樣量:10.0 μL;流速:0.6 mL/min;檢測(cè)器:DAD檢測(cè)器;檢測(cè)波長:210 nm;柱溫:30 ℃。

1.2.2 荸薺皮提取物及其稀釋液的制備 a. 稱取10.0 kg荸薺皮粉,加入提取罐中,用70%丙酮提取(3×40 L),減壓濃縮回收丙酮,得荸薺皮70%丙酮總提取物,60 kPa、50 ℃下減壓濃縮得0.98 kg干品。b. 將荸薺皮70%丙酮總提取物以1∶5的比例加水懸浮,分別用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取3次,正丁醇萃取后剩余部分的水層為水萃取物,將上述萃取物以同樣方法減壓濃縮回收溶劑,分別得石油醚萃取物15.5 g、乙酸乙酯萃取物57.5 g、正丁醇萃取物92.3 g,水萃取物0.71 kg。c. 將正丁醇萃取物完全溶解,用D101大孔樹脂分離,依次用25%、55%、95%乙醇進(jìn)行梯度洗脫,收集洗脫液,同樣方法減壓濃縮后所得干品,質(zhì)量分別為15.09、4.58、1.45 g。d. 把前述a、b、c中所得物質(zhì)分別用超純水配制成濃度為1.0、1.0×10-1、1.0×10-2、1.0×10-3、1.0×10-5、1.0×10-7、1.0×10-9mg/mL的稀釋液,各10.0 mL備用。

1.2.3 土豆脆片樣品的制備 預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在160 ℃下焙烤5 min所得土豆脆片的色澤、氣味、脆度、韌度和硬度最好,本文按此條件制備土豆脆片樣品。

稱取烘干至恒重的土豆粉36份,每份2.00 g,分別加入1.1 mL由1.2.2(d)中所配制的各稀釋液進(jìn)行和粉,空白對(duì)照組加入等量超純水進(jìn)行和粉,稱取1.60 g和好的土豆粉,用模具壓成厚度為1.0 mm、直徑為4.0 cm的薄片,放入烘箱,在160 ℃下焙烤5 min后取出,迅速冷卻,制成質(zhì)量為1.12 g/片的土豆脆片樣品。

1.2.4 樣品中丙烯酰胺含量的測(cè)定 用研缽把1.12 g的土豆脆片研成細(xì)粉,移入50 mL離心管中,并用超純水潤洗研缽,總共加入3.5 mL超純水于離心管中提取丙烯酰胺,再分別加入蛋白質(zhì)沉淀劑15%亞鐵氰化鉀溶液和30%硫酸鋅溶液各1.0 mL,室溫下660 r/min攪拌5 min,再以4000 r/min離心20 min,得上清液2.5 mL。取上清液0.5 mL,過C18固相萃取小柱,用1.5 mL超純水洗脫,收集洗脫液,過0.45 μm水系針筒式微孔濾膜,按1.2.1的方法測(cè)定丙烯酰胺色譜峰面積。每組進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn),根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線,由色譜峰面積計(jì)算丙烯酰胺含量,計(jì)算公式如下:

樣品中丙烯酰胺含量(μg/g)=(C×1.5 mL)×(2.5/0.5)÷1.12 g

式中:C-樣品中丙烯酰胺色譜峰面積對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線中丙烯酰胺的濃度,μg/mL。

丙烯酰胺抑制率(%)=[(AM0-AM)/AM0]×100%

式中:AM0-空白對(duì)照組丙烯酰胺含量,μg/g;AM-實(shí)驗(yàn)組丙烯酰胺含量,μg/g。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理采用WPS Office 2016進(jìn)行,作圖軟件為Origin 7.5。

2 結(jié)果與分析

2.1 丙烯酰胺的高效液相色譜圖

圖1為丙烯酰胺標(biāo)品在1.2.1條件下測(cè)得的高效液相色譜圖,圖2為同一條件下所測(cè)得土豆脆片樣品的高效液相色譜圖。圖1可見,丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相色譜峰峰形良好,保留時(shí)間為8.50 min,對(duì)比可見,圖2中保留時(shí)間8.50 min處可見目標(biāo)峰,該丙烯酰胺峰峰形良好,與其它雜峰能夠很好地分離,可見此樣品處理方法和檢測(cè)條件,適用于土豆脆片中丙烯酰胺含量的檢測(cè)。

圖1 丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)品高效液相色譜圖(1.25 μg/mL)Fig.1 HPLC of standard acrylamide(1.25 μg/mL)

圖2 土豆脆片樣品中的丙烯酰胺高效液相色譜圖Fig.2 HPLC of acrylamide in potato chip samples

2.2 荸薺皮提取物濃度對(duì)丙烯酰胺抑制效果的影響

由圖3可知,荸薺皮70%丙酮總提取物、不同極性萃取物對(duì)土豆脆片焙烤中丙烯酰胺的形成均有抑制作用,但這些添加物濃度與丙烯酰胺含量之間呈非線性關(guān)系,這與荔枝原花青素(LPPC)、蓮房原花青素(LSPC)和紫麥麩皮提取物等對(duì)丙烯酰胺的抑制規(guī)律一致[19-20]。由圖3、圖4看出,在所有荸薺皮提取物中,石油醚萃取物的最佳抑制濃度為1.0×10-7mg/mL,此時(shí)達(dá)到最大抑制率13.02%,隨著濃度的增加丙烯酰胺抑制效果逐漸減弱;荸薺皮70%丙酮總提取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物、水萃取物等添加物的最佳抑制濃度均為1.0×10-3mg/mL,抑制率分別為11.73%、13.02%、10.81%、17.14%、12.52%,可見抑制效果最好的添加物是正丁醇萃取物,添加物濃度再繼續(xù)增加時(shí),對(duì)丙烯酰胺的抑制效果也逐漸減弱,這一規(guī)律與張永菊[20]在天冬酰胺/葡萄糖低濕模擬體系中,研究紫麥麩皮提取物花色苷及其五種花色苷混合物(混合比例1∶1∶1∶1∶1)對(duì)丙烯酰胺的抑制作用規(guī)律相吻合。此外,石油醚萃取物、70%丙酮總提取物、乙酸乙酯萃取物、水萃取物在高濃度水平1.0×10-1～1.0 mg/mL之間,表現(xiàn)出對(duì)丙烯酰胺含量增加的效果,這也與張永菊[20]所指出的錦葵色素-3-葡萄糖苷對(duì)丙烯酰胺的抑制作用規(guī)律相類似,這其中的原因有待進(jìn)一步研究。

圖3 不同濃度荸薺皮提取物對(duì)丙烯酰胺含量的影響Fig.3 The effect of different concentration extracts of Eleocharis tuberose peel on acrylamide content

圖4 不同濃度荸薺皮提取物對(duì)丙烯酰胺抑制率的影響Fig.4 Comparison of inhibition rates of acrylamide with the different concentration extracts of Eleocharis tuberose peel

2.3 乙醇洗脫液對(duì)丙烯酰胺抑制效果的影響

正丁醇萃取物經(jīng)D101大孔樹脂分離純化后的乙醇梯度洗脫液對(duì)丙烯酰胺抑制效果的影響見圖5、圖6。

圖5 不同濃度乙醇洗脫液對(duì)丙烯酰胺含量的影響Fig.5 The inhibition effect of diffrent concentrates of ethanol eluents on acrylamide content

圖6 不同濃度乙醇洗脫液對(duì)丙烯酰胺抑制率的影響Fig.6 Comparison of inhibition rates of acrylamide with different concentration of ethanol eluents

圖5、圖6可見,不同濃度乙醇洗脫液對(duì)土豆脆片中丙烯酰胺的形成均有抑制作用,其中25%的乙醇洗脫液的最佳抑制濃度為1.0×10-5mg/mL,其抑制率為24.69%,而55%和95%的乙醇洗脫液的最佳抑制濃度分別為1.0×10-3mg/mL,其抑制率分別為3.91%、15.44%,可見25%的乙醇洗脫液對(duì)丙烯酰胺的抑制效果優(yōu)于55%、95%乙醇洗脫液,且其抑制率比正丁醇萃取物高44.04%,由此可見荸薺皮提取物的分離純化物有助于土豆脆片加工中丙烯酰胺抑制率的提高,這為下一步從25%的乙醇洗脫液中分離篩選出更高效的丙烯酰胺天然抑制劑提供了科學(xué)依據(jù)。

3 結(jié)論

綜上所述,在荸薺皮提取物應(yīng)用于土豆脆片焙烤過程的丙烯酰胺抑制效果研究中發(fā)現(xiàn),荸薺皮70%丙酮總提取物、不同極性萃取物、以及正丁醇萃取物經(jīng)大孔樹脂純化分離后的乙醇洗脫液,均對(duì)土豆脆片焙烤中的丙烯酰胺的形成有抑制作用,且對(duì)抑制效果最好的部位進(jìn)一步分離純化的所得物,其丙烯酰胺抑制效果更好。其中,在70%丙酮總提取物、石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物、水萃取物中,正丁醇萃取物對(duì)丙烯酰胺的抑制效果最優(yōu),在最佳抑制濃度1.0×10-3mg/mL時(shí)，其抑制率達(dá)到17.14%;將正丁醇萃取物經(jīng)D101大孔樹脂純化分離后,以不同梯度的乙醇溶液進(jìn)行洗脫,3個(gè)不同濃度的乙醇洗脫液中,25%乙醇洗脫液對(duì)丙烯酰胺的抑制效果最好,在最佳抑制濃度1.0×10-5mg/mL時(shí)抑制率達(dá)到24.69%,其抑制率比正丁醇萃取物抑制率高44.04%,這說明在丙烯酰胺抑制的最高效部位進(jìn)一步分離純化,容易獲得丙烯酰胺抑制活性最好的成分,此研究結(jié)果為進(jìn)一步從荸薺皮中篩選具有更高活性的丙烯酰胺抑制成分指明了方向。