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        響應(yīng)面優(yōu)化乙酸提取黑米花色苷工藝

        2018-11-27 01:54:58蔡文韜馮麗娜陳慕雪
        現(xiàn)代食品 2018年18期
        關(guān)鍵詞:影響

        ◎ 蔡文韜,馮麗娜,陳慕雪

        (廣東第二師范學(xué)院,廣東 廣州 510303)

        黑米屬功能稻米的一種,其中含有植酸、異牡荊黃素、γ-谷維素、植物甾醇類、二十八醇、鯊稀、GABA、維生素E和生育三稀甘油酯衍生物等多種活性物質(zhì)。黑米具有抗癌、消炎、抗糖尿病、降血脂、抗疲勞和防治心血管疾病等功效[1],花色苷是自然界廣泛分布的一種植物多酚,是一種水溶性黃酮化合物,在大部分植物花瓣和果實(shí)種皮中都存在花色苷。而花色苷,則是黑米米皮中的主要成分[2-3]。有文獻(xiàn)表明[4],黑米其色澤在稻谷中屬最深,其功效在各種稻米中也屬最強(qiáng)?;ㄉ兆鳛樗局匾幕钚晕镔|(zhì)之一,具有抗氧化、降血脂、抑制腫瘤細(xì)胞生長、抑菌抗炎和抗過敏作用,并且能有效預(yù)防心血管疾病、慢性失調(diào)癥和退化性疾病等疾病。

        1 材料

        1.1 試驗(yàn)材料

        黑米:采購于農(nóng)貿(mào)市場。

        1.2 化學(xué)試劑

        冰醋酸、pH為1.0的HCl-KCl緩沖液、pH為4.5的HCl-CCOONa緩沖液。

        1.3 試驗(yàn)儀器

        紫外可見分光光度計(jì)、食物粉碎機(jī)、布氏漏斗。

        2 實(shí)驗(yàn)方法

        2.1 工藝流程

        黑米→清洗→烘箱干燥→破碎→提取→抽濾→加入緩沖液→測吸光值→計(jì)算花色苷得率。

        2.2 原料處理

        黑米用蒸餾水洗凈,置于烘箱,調(diào)節(jié)烘箱溫度,使其達(dá)60 ℃,在此溫度下烘干3 h,取出烘干完畢的黑米,使用粉碎機(jī)將烘干的黑米粉碎,得黑米粉末。

        2.3 黑米花色苷含量測定方法

        黑米花色苷含量的測定采用pH示差法[5],據(jù)pH示差法的原理,分別取pH為1.0的HCl-KCl緩沖液和pH為4.5的HCl-CCOONa緩沖液各5 mL,分別加入1 mL黑米提取液中,混勻,在室溫下避光平衡10 min,用蒸餾水做空白對照,在矢車菊素-3-葡萄糖苷最大吸收波長510 nm和700 nm下,測定黑米提取液的吸光值,稀釋樣品的吸光值以及原始樣品中花色苷含量的計(jì)算公式如下:

        式中:TAcy為提取物中黑米花色苷含量,mg/g;V為提取液總體積,mL;n為稀釋倍數(shù);M為矢車菊素-3-葡萄糖苷的分子質(zhì)量,499.2;ε為矢車菊素-3-葡萄糖苷的消光系數(shù),26 900;A為樣品的吸光值;m為原料的質(zhì)量,g。

        2.4 黑米花青素提取的單因素實(shí)驗(yàn)

        稱取黑米粉2.0 g,采用乙酸作為提取劑,以黑米花色苷含量作為參考指標(biāo),依次對其提取劑濃度、提取時(shí)間、提取溫度以及提取料液比進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

        2.4.1 提取劑的選擇

        國內(nèi)現(xiàn)有文獻(xiàn)資料關(guān)于黑米花色苷的提取方法中,一般選擇乙醇-水溶液作為提取劑[6-7],但據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)資料顯示[8],酸化水溶液對黑米中的花色苷類物質(zhì)也具有相當(dāng)好的提取能力??紤]到相對于酸化的醇溶液,酸化的水溶液的成本要低得多。因此,此實(shí)驗(yàn)選擇乙酸作為提取劑提取色素。

        2.4.2 提取濃度對黑米花色苷含量的影響

        稱取2 g黑米粉,分別溶于40 mL的5%、10%、15%、20%和25%乙酸中,在40℃恒溫水浴鍋中浸提60 min,抽濾,收集上清液。取上清液2 mL,分別加入pH為1.0的緩沖液(0.2 mol/L KCl-HCl緩沖液)或pH4.5的緩沖液(HCl-CCOONa溶液)稀釋至適當(dāng)倍數(shù),放置10 min,在510 nm或700 nm處測吸光值,平行3組。

        2.4.3 提取時(shí)間對黑米花色苷含量的影響

        稱取2g黑米粉,溶于40 mL的15%乙酸中,在40℃恒溫水浴鍋中分別浸提30、45、60、75 min和90 min,抽濾,收集上清液。取上清液2 mL,分別加入pH1.0緩沖液(0.2 mol/L KCl-HCl緩沖液)或pH4.5的緩沖液(HCl-CCOONa溶液)稀釋至適當(dāng)倍數(shù),放置10 min,在510 nm或700 nm處測吸光值,平行3組。

        2.4.4 提取溫度對黑米花色苷含量的影響

        稱取2 g黑米粉,溶于40 mL的15%乙酸中,分別在20、30、40、50℃和60℃恒溫水浴鍋中浸提60 min,抽濾,收集上清液。取上清液2 mL,分別加入pH1.0的緩沖液(0.2 mol/L KCl-HCl緩沖液)或pH4.5的緩沖液(HCl-CCOONa溶液)稀釋至適當(dāng)倍數(shù),放置10 min,在510 nm或700 nm處測吸光值,平行3組。

        2.4.5 提取料液比對黑米花色苷含量的影響

        稱取2 g黑米粉,溶于20、30、40、50 mL和60 mL的15%乙酸中,在40℃恒溫水浴鍋中浸提60 min,抽濾,收集上清液。取上清液2 mL,分別加入pH1.0緩沖液(0.2 mol/L KCl-HCl緩沖液)或pH4.5的緩沖液(HCl-CCOONa溶液)稀釋至適當(dāng)倍數(shù),放置10 min,在510 nm或700 nm處測吸光值,平行3組。

        2.5 黑米花色苷提取工藝參數(shù)的優(yōu)化

        在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,根據(jù)Box-Benhnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,采用響應(yīng)面法進(jìn)行4因素3水平的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì),對水浴提取黑米花色苷的條件進(jìn)行優(yōu)化。

        3 結(jié)果與分析

        3.1 黑米花色苷提取單因素試驗(yàn)

        3.1.1 提取劑濃度對提取黑米花色苷含量的影響

        在乙酸體積為40 mL,提取時(shí)間60 min,固液比為1∶20,提取溫度為40 ℃的條件下,提取劑-乙酸濃度對提取物中黑米花色苷含量的影響結(jié)果見圖1。從圖1可看出,當(dāng)提取劑濃度為10%時(shí),黑米花色苷含量達(dá)到最高,當(dāng)繼續(xù)增加提取劑濃度時(shí),黑米花色苷含量持續(xù)降低,當(dāng)提取劑濃度為20%時(shí),黑米花色苷含量達(dá)到最低點(diǎn),過后升高。分析原因可能是,高濃度的提取劑會抑制黑米中花色苷的顯色,導(dǎo)致降低黑米中花色苷的含量。當(dāng)提取劑濃度達(dá)到一定時(shí),又反而可促進(jìn)其顯色,使其花色苷含量升高。

        圖1 提取劑濃度對黑米花色苷含量的影響圖

        3.1.2 提取時(shí)間對黑米花色苷含量的影響

        在乙酸體積分?jǐn)?shù)為15%,固液比為1∶20,提取溫度為40 ℃的條件下,提取時(shí)間對黑米花色苷含量的影響如圖2。從圖2可知,當(dāng)提取時(shí)間為45 min時(shí),黑米中花色苷含量達(dá)到最大值,而之后隨著提取時(shí)間的延長,提取物中黑米花色苷的含量逐漸降低。分析原因可能為,隨著時(shí)間增加,黑米中的花色苷被破壞,使得提取物中花色苷含量降低。

        圖2 提取時(shí)間對黑米花色苷含量的影響圖

        3.1.3 提取溫度對黑米花色苷含量的影響

        在乙酸體積分?jǐn)?shù)為15%,固液比為1∶20,提取時(shí)間為60 min的條件下,提取溫度對黑米花色苷含量的影響如圖3。從圖3可知,在溫度為40℃時(shí),提取物中黑米中花色苷含量達(dá)到最高。曲線曲折上升的原因在于,一定的低溫能保證黑米中的花色苷不受破壞。

        圖3 提取溫度對黑米花色苷含量的影響圖

        3.1.4 提取料液比對黑米花色苷含量的影響

        在乙酸體積分?jǐn)?shù)為15%,提取溫度為40 ℃,提取時(shí)間為60 min的條件下,提取料液比對黑米花色苷含量的影響如圖4。從圖4可知,隨著料液比的增加,黑米花色苷含量是減少的,原因可能在于,提取液會抑制黑米花色苷的析出,導(dǎo)致花色苷提取量降低。

        圖4 提取料液比對黑米花色苷含量的影響圖

        3.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

        3.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)方案

        根據(jù)Box-Benhnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果,選取提取劑濃度、料液比、提取溫度以及提取時(shí)間4個(gè)因素,試驗(yàn)因素水平如表1。采用Design Expert8.0設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)。結(jié)果如表2所示。

        表2中,試驗(yàn)號2、5、17、19和26為中心試驗(yàn),其余為析因試驗(yàn)。共有25組析因試驗(yàn),5組中心試驗(yàn)。其中,析因點(diǎn)是自變量取值在各因素水平所構(gòu)成的三維頂點(diǎn);中心試驗(yàn)點(diǎn)用以估計(jì)試驗(yàn)誤差。

        表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表

        表2 花色苷提取工藝優(yōu)化響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果表

        3.2.2 回歸方程和方差分析

        根據(jù)表3回歸模型方差分析,分析回歸方程和方差。

        表3 回歸模型方差分析表

        采用Design Expert 8.0軟件對表3試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元次回歸擬合分析得到花色苷含量與各因素變量的多元二次方程模型為:Y=0.033+0.005 554A-0.006 624B+0.001 024C-0.002 787D-0.000 350 5AB+0.001 24AC-0.000 618AD-0.001 365BC+0.001 866BD-0.001 536CD-0.000 905 7A2+0.002 056B2-0.003 868C2-0.006 755D2。

        從表3二次響應(yīng)面回歸模型的方差分析結(jié)果可知,模型的P<0.000 1,說明對黑米花色苷提取建立的回歸模型是極顯著的;模型的變異系數(shù)(C.V.%)=0.10%,低,表明該模型精確度高,試驗(yàn)可信;模型決定系數(shù)R2=0.930 5,校正系數(shù)R2Adj=0.855 6,表示模型的擬合度較好,預(yù)測值與實(shí)際值之間具有較高的相關(guān)性,試驗(yàn)誤差較小。因此可用該回歸方程代替試驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析和預(yù)測。

        將二次回歸方程中一次項(xiàng)系數(shù)絕對值大小作為各參數(shù)對黑米花色苷含量影響的比較依據(jù),得出所考察的4個(gè)因素對黑米花色苷含量影響的大小依次為:B>A>D>C,即料液比>提取劑濃度>提取溫度>提取時(shí)間。

        3.2.3 因素間相互作用響應(yīng)面分析結(jié)果

        各因素交互作用對黑米花色苷含量影響的響應(yīng)面圖如圖5所示。

        圖5 各因素交互作用對黑米花色苷含量影響的響應(yīng)面圖

        為進(jìn)一步研究各因素交互作用對黑米花色苷含量的影響,采用Design Expert 8.0軟件繪制了三維響應(yīng)面圖,從圖5可看出,BD的交互作用對黑米花色苷含量的影響是顯著的,隨著提取溫度的升高和料液比的增加,黑米花色苷含量是先上升,后下降的。

        利用Design Expert 8.0軟件分析,當(dāng)黑米中花色苷含量最高時(shí),與其對應(yīng)的黑米花色苷的最佳提取條件為:提取劑濃度為20%,料液比為1∶10,提取時(shí)間為56 min,提取溫度為44.81℃,在此條件下,理論上得出的最佳花色苷含量為0.052 815 7 mg/g。

        3.2.4 試驗(yàn)驗(yàn)證

        為了驗(yàn)證響應(yīng)面分析結(jié)果的可行性,采用響應(yīng)面法優(yōu)化的工藝條件,進(jìn)行了水浴法提取黑米花色苷的驗(yàn)證試驗(yàn)??紤]到操作的便利性,將提取條件稍作修改,改為提取劑濃度20%,料液比1∶10,提取時(shí)間56 min,提取溫度45℃。平行3次,最終得到的黑米花色苷含量為0.055 482 mg/g>0.052 815 7 mg/g。說明響應(yīng)面法對黑米花色苷提取條件的優(yōu)化是可行的。

        4 結(jié)論

        本次試驗(yàn)在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,運(yùn)用響應(yīng)面法對黑米花色苷提取的工藝進(jìn)行優(yōu)化?;貧w結(jié)果表明,料液比對黑米花色苷含量的影響是最大的。且回歸分析和驗(yàn)證結(jié)果均表明,該方法是可行的。最終,得到了水浴提取黑米花色苷的最佳條件:提取劑濃度為20%,料液比為1∶10,提取時(shí)間為56 min,提取溫度為45 ℃,得到黑米花色苷的實(shí)際含量為0.055 482 mg/g。

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