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        苯酚-硫酸法與蒽酮-硫酸法測定麥冬中麥冬多糖含量的比較研究

        2018-11-27 01:54:52劉太林
        現(xiàn)代食品 2018年18期

        ◎ 張 妍,劉太林

        (天津天獅學(xué)院,天津 301700)

        麥冬 [Ophiopogon japonicas (Thunb.) Ker-Gawl]為百合科沿階草屬多年生植物麥冬的干燥肉質(zhì)塊莖,主要分布于四川、浙江及江蘇一帶[1-3]。《本草匯言》中記載:麥門冬,味甘、微苦,性微寒,歸心、肺、胃經(jīng),可為清心潤肺之藥,常與其他中藥配伍,用于治療肺燥干咳、津傷口渴,心煩失眠、內(nèi)熱消渴以及腸燥便秘等[4]。麥冬的有效成分包括甾體皂苷、多糖、異黃酮和氨基酸等,其中麥冬多糖含量較高,其藥理作用主要表現(xiàn)為抗腫瘤、抗心肌缺血、抗氧化、抗過敏、降低血糖、增強機體免疫、潤肺平喘并保護外分泌腺等[5-8]。植物多糖的測定方法主要包括苯酚-硫酸法[9-11]、蒽酮-硫酸法[12-14]、還原糖測定法[15-16]、高效液相色譜法[17-18]、酶法[19-20]等,當(dāng)前文獻報道植物多糖測定方法以苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法較為多見。本文分別采用苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法測定麥冬中麥冬多糖含量,并對測定方法進行比較分析,為確定合理的麥冬多糖含量測定方法提供依據(jù)。

        1 試驗材料

        麥冬為市售藥材;無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品:上海源葉生物科技有限公司(純度≥98%);蒽酮:上海國藥試劑集團;苯酚、濃硫酸:天津市大茂化學(xué)試劑廠(分析純);無水乙醇(分析純):天津市匯杭化工科技有限公司。

        UV-2500型紫外可見分光光度計:島津儀器有限公司;100~1 000 μL、1 000~5 000 μL移液器:大龍興創(chuàng)實驗儀器有限公司;BSA124S型精密分析天平:賽多利斯科學(xué)儀器有限公司;WE-1型水浴恒溫振蕩器:天津市歐諾儀器儀表有限公司;RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀:上海亞榮生化儀器廠;DH-101-3BS型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱:天津市中環(huán)實驗電爐有限公司;TD5K-Ⅲ型低速離心機:長沙東旺實驗儀器有限公司。

        2 試驗方法

        2.1 試驗溶液的配制

        2.1.1 麥冬多糖溶液的制備

        麥冬干燥后粉碎過80目篩,精密稱取2 g麥冬粉末并加入50倍量純化水,于70 ℃、振蕩頻率100 r/min條件下水浴振蕩提取2 h,過濾除去藥渣后減壓濃縮至濃稠,加入8倍量冷無水乙醇靜置過夜,離心取下層多糖稠膏,加入適量水溶出并定容至100 mL搖勻,再稀釋250倍后搖勻得到麥冬多糖溶液。

        2.1.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

        精密稱取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品5 mg,用蒸餾水定容至50 mL中,得到0.1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液貯備液。分別量取0.1、0.2、0.3、0.4、0.8 mL和1.0 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液貯備液置于10 mL容量瓶中稀釋至刻度線,搖勻,即為濃度10、20、30、40、80 μg/mL和100 μg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。

        2.1.3 苯酚溶液的制備

        稱取苯酚100 g,加0.1 g鋁片和0.05 g碳酸氫鈉常壓蒸餾,收集(180±2)℃餾分[13]。精密稱取餾分10 g,加蒸餾水定容至100 mL搖勻置于棕色試劑瓶中冰箱保存。

        2.1.4 蒽酮-硫酸溶液的制備

        精密稱取0.5 g蒽酮,溶解于100 mL濃硫酸中,置于棕色試劑瓶中冰箱保存(臨用現(xiàn)配)。

        2.2 苯酚-硫酸法測定多糖含量

        2.2.1 反應(yīng)產(chǎn)物最大吸收波長的確定

        分別精密量取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液與麥冬多糖溶液2 mL置于比色管中,室溫下分別加入6%苯酚溶液1 mL搖勻,緩慢加入濃硫酸5 mL,混勻后置于50 ℃條件下水浴顯色20 min,流水冷卻至室溫,在400~700 nm波長區(qū)域掃描吸收曲線。

        2.2.2 苯酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)的確定

        取樣品溶液2 mL置于比色管中,以2 mL蒸餾水作為空白對照,室溫下加入濃度分別為3%、4%、5%、6%和8%苯酚溶液1 mL搖勻,緩慢加入濃硫酸5 mL,混勻后置于50 ℃水浴顯色20 min,流水冷卻至室溫,在490 nm處測定其吸光值,計算多糖含量。

        2.2.3 濃硫酸用量的確定

        取樣品溶液2 mL置于比色管中,以2 mL蒸餾水作為空白對照,室溫下加入6%苯酚溶液1 mL搖勻,分別緩慢加入濃硫酸4、5、6、8 mL和10 mL,混勻后置于50 ℃條件下水浴顯色20 min,流水冷卻至室溫,在490 nm處測定其吸光值,計算多糖含量。

        2.2.4 反應(yīng)溫度的確定

        取樣品溶液2 mL置于比色管中,以2 mL蒸餾水作為空白對照,室溫下加入6%苯酚溶液1 mL搖勻,緩慢加入濃硫酸5 mL,混勻后分別置于30、40、50、60 ℃和70 ℃條件下水浴顯色20 min,流水冷卻至室溫,在490 nm處測定其吸光值,計算多糖含量。

        2.2.5 反應(yīng)時間的確定

        取樣品溶液2 mL置于比色管中,以2 mL蒸餾水作為空白對照,室溫下加入6%苯酚溶液1 mL搖勻,分別緩慢加入濃硫酸5 mL,混勻后置于50 ℃條件下水浴分別顯色10、15、20、25 min和30 min,流水冷卻至室溫,在490 nm處測定其吸光值,計算多糖含量。

        2.2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

        分別取各濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液2 mL置于比色管中,以2 mL蒸餾水作為空白對照,按照上述試驗優(yōu)化得到的最佳試驗條件參數(shù),在490 nm處分別依次測定吸光值,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

        2.2.7 方法學(xué)指標(biāo)的考察

        取麥冬多糖溶液,按照上述試驗優(yōu)化得到的最佳試驗條件參數(shù),分別依次進行該方法的精密度、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性以及加樣回收率的考察。

        2.2.8 麥冬多糖含量的測定

        取麥冬多糖溶液,按照上述試驗優(yōu)化得到的最佳試驗條件參數(shù),測定其吸光值,通過線性回歸方程計算麥冬多糖含量。

        2.3 蒽酮-硫酸法測定多糖含量

        2.3.1 反應(yīng)產(chǎn)物最大吸收波長的確定

        分別精密量取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液與麥冬多糖溶液2 mL置于比色管中,冰水浴中加入0.5%蒽酮-硫酸溶液4 mL搖勻,混勻后沸水浴中顯色15 min,迅速置于冰水中冷卻,在400~700 nm波長區(qū)域掃描吸收曲線。

        2.3.2 蒽酮-硫酸溶液用量的確定

        取樣品溶液2 mL置于比色管中,以2 mL蒸餾水作為空白,冰水浴中加入0.5%蒽酮-硫酸溶液2、3、4、5 mL和6 mL搖勻,混勻后沸水浴中顯色15 min,迅速置于冰水中冷卻,在620 nm處測定其吸光值,計算多糖含量。

        2.3.3 反應(yīng)溫度的確定

        取樣品溶液2 mL置于比色管中,以2mL蒸餾水作為空白,冰水浴中加入0.5%蒽酮-硫酸溶液4 mL搖勻,混勻后分別置于60、70、80、90 ℃和100 ℃水浴中顯色15 min,迅速置于冰水中冷卻,在620 nm處測定其吸光值,計算多糖含量。

        2.3.4 反應(yīng)時間的確定

        取樣品溶液2 mL置于比色管中,以2 mL蒸餾水作為空白,冰水浴中加入0.5%蒽酮-硫酸溶液4 mL搖勻,混勻后沸水浴中分別顯色10、15、20、25 min和30 min,迅速置于冰水中冷卻,在620 nm處測定其吸光值,計算多糖含量。

        2.3.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

        分別取各濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液2 mL置于比色管中,以2 mL蒸餾水作為空白對照,按照上述試驗優(yōu)化得到的最佳試驗條件參數(shù),在620 nm處分別測定吸光值,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

        2.3.6 方法學(xué)指標(biāo)的考察

        取麥冬多糖溶液,按照上述試驗優(yōu)化得到的最佳試驗條件參數(shù),分別進行該方法的精密度、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性以及加樣回收率考察。

        2.3.7 麥冬多糖含量的測定

        取麥冬多糖溶液,按照上述試驗優(yōu)化得到的最佳試驗條件參數(shù),測定其吸光值,通過線性回歸方程計算麥冬多糖含量。

        3 結(jié)果與分析

        3.1 苯酚-硫酸法與蒽酮-硫酸法最大吸收波長的比較

        采用兩種方法分別對葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液和麥冬多糖溶液進行處理,經(jīng)UV-2500紫外可見分光光度計掃描其在波長400~700 nm區(qū)域的最大吸收波長,其波長曲線如圖1、圖2所示。A曲線表示苯酚-硫酸法,B曲線表示蒽酮-硫酸法。

        圖1 葡萄糖溶液吸收波長比較圖

        圖2 麥冬多糖溶液吸收波長比較圖

        由圖1和圖2可見,采用苯酚-硫酸法測定時,葡萄糖和麥冬多糖在488 nm波長處有明顯的最大吸收峰,其余波段無干擾峰,表明麥冬多糖在苯酚-硫酸作用下生成絡(luò)合衍生物組分單一,顯色效果良好。采用蒽酮-硫酸法測定時,葡萄糖和麥冬多糖在400~700 nm波長范圍內(nèi)吸收波長變化較大,在620 nm波長處出現(xiàn)較大吸收峰,但與苯酚-硫酸法相比,最大吸收峰穩(wěn)定性較差,且存在干擾峰,測定方法準(zhǔn)確性不高。

        3.2 苯酚-硫酸法與蒽酮-硫酸法最佳條件的確定

        3.2.1 苯酚-硫酸法最佳條件的確定

        苯酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)、濃硫酸用量、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間對麥冬多糖吸光度值的影響如圖3所示。綜合考慮,苯酚-硫酸法測定麥冬多糖含量最佳條件為苯酚質(zhì)量分?jǐn)?shù) 6%、硫酸用量5 mL、反應(yīng)溫度50 ℃、反應(yīng)時間20 min。

        圖3 4種因素對吸光度值的影響圖

        3.2.2 蒽酮-硫酸法最佳條件的確定

        蒽酮-濃硫酸溶液用量、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間對麥冬多糖吸光度值的影響如圖4所示。綜合考慮,蒽酮-硫酸法測定麥冬多糖含量最佳條件為蒽酮-硫酸用量4 mL、反應(yīng)溫度100 ℃、反應(yīng)時間15 min。

        圖4 3種因素對吸光度值的影響圖

        3.3 苯酚-硫酸法與蒽酮-硫酸法標(biāo)準(zhǔn)曲線線性的比較

        以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo),對應(yīng)的吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,如圖5所示。采用苯酚-硫酸法所得回歸方程為y=27.011x-0.0964(R2=0.999 1),在10~100 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,而采用蒽酮-硫酸法所得回歸方程為y=22.929x-0.0513(R2=0.996 4),與苯酚-硫酸法相比,在10~100 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性較差。

        圖5 兩種方法測定葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的比較圖

        3.4 苯酚-硫酸法與蒽酮-硫酸法方法學(xué)指標(biāo)的比較

        3.4.1 苯酚-硫酸法與蒽酮-硫酸法精密度的比較

        如表1所示,苯酚-硫酸法測定麥冬多糖的精密度相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.58%,小于蒽酮-硫酸法的測定結(jié)果1.96%,故苯酚-硫酸法的精密度略優(yōu)于蒽酮-硫酸法。

        表1 兩種方法測定麥冬多糖精密度的比較表

        3.4.2 苯酚-硫酸法與蒽酮-硫酸法重復(fù)性的比較

        如表2所示,苯酚-硫酸法測定麥冬多糖的重復(fù)性相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.90%,明顯小于蒽酮-硫酸法的測定結(jié)果3.53%,故苯酚-硫酸法的重復(fù)性優(yōu)于蒽酮-硫酸法。

        表2 兩種方法測定麥冬多糖重復(fù)性的比較表

        3.4.3 苯酚-硫酸法與蒽酮-硫酸法穩(wěn)定性的比較

        如表3所示,在0~120 min內(nèi),苯酚-硫酸法測定麥冬多糖的穩(wěn)定性相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.46%,略大于蒽酮-硫酸法的測定結(jié)果0.34%,故蒽酮-硫酸法穩(wěn)定性略優(yōu)于苯酚-硫酸法。

        表3 兩種方法測定麥冬多糖穩(wěn)定性的比較表

        3.4.4 苯酚-硫酸法與蒽酮-硫酸法加樣回收率的比較

        如表4所示,苯酚-硫酸法測定麥冬多糖的加樣回收率為100.63%,優(yōu)于蒽酮-硫酸法的測定加樣回收率101.67%,且其RSD亦優(yōu)于蒽酮-硫酸法,故苯酚-硫酸法加樣回收率優(yōu)于蒽酮-硫酸法。

        表4 兩種方法測定麥冬多糖加樣回收率的比較表

        3.5 苯酚-硫酸法與蒽酮-硫酸法測定麥冬多糖含量的比較

        如表5所示,苯酚-硫酸法測定麥冬多糖含量為42.96%,其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.73%,蒽酮-硫酸法測定麥冬多糖含量為38.56%,其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.40%。由此看出,苯酚-硫酸法測定多糖含量高于蒽酮-硫酸法,且相對標(biāo)準(zhǔn)偏差也較小,故苯酚-硫酸法優(yōu)于蒽酮-硫酸法。

        表5 兩種方法測定麥冬多糖含量的比較表

        4 結(jié)論

        本研究以麥冬多糖作為研究對象,研究比較兩種檢測方法對其測定結(jié)果的影響,并對兩種方法的檢測條件進行了優(yōu)化。苯酚-硫酸法測定麥冬多糖含量最佳條件為苯酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%、硫酸用量5 mL、反應(yīng)溫度50 ℃、反應(yīng)時間20 min,測得麥冬多糖含量為42.96%。蒽酮-硫酸法測定麥冬多糖含量最佳條件為蒽酮-硫酸用量4 mL、反應(yīng)溫度100 ℃、反應(yīng)時間15 min,測得麥冬多糖含量為38.56%。在葡萄糖濃度10~100 μg/mL范圍內(nèi),苯酚-硫酸法測定葡萄糖所得標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)(R2=0.999 1)大于蒽酮-硫酸法標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)(R2=0.996 4),說明苯酚-硫酸法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系較好。苯酚-硫酸法測定麥冬多糖精密度RSD為1.58%、重復(fù)性RSD為1.90%、0~120 min內(nèi)穩(wěn)定性RSD為0.46%、加樣回收率為100.63%。蒽酮-硫酸法測定麥冬多糖精密度RSD為1.96%、重復(fù)性RSD為3.53%、0~120 min內(nèi)穩(wěn)定性RSD為0.34%、加樣回收率為101.67%。

        結(jié)果表明:兩種方法均具備操作簡單、快速、準(zhǔn)確和條件易于控制等優(yōu)點,均適用于麥冬多糖成分的測定。綜合上述實驗結(jié)果考慮,相對于蒽酮-硫酸法,苯酚-硫酸法更加適用于麥冬多糖含量的測定,且與苯酚-硫酸法相比,蒽酮-硫酸法最大吸收峰穩(wěn)定性較差,且存在干擾峰,測定方法準(zhǔn)確性較差,故在麥冬中麥冬多糖含量測定時可優(yōu)先考慮苯酚-硫酸法。

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