史國(guó)帥 白 莉 周立光

(1:吉林建筑大學(xué) 市政與環(huán)境工程學(xué)院,長(zhǎng)春 130118;2:中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心飲用水科學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100085)

0 引言

硝化過(guò)程是微生物將氨氧化為硝酸鹽的生物學(xué)過(guò)程,是自然界中氮循環(huán)的關(guān)鍵過(guò)程,也是許多農(nóng)業(yè)應(yīng)用的重要方面.自19世紀(jì)90年代硝化過(guò)程被發(fā)現(xiàn)以來(lái),傳統(tǒng)的硝化過(guò)程一直被認(rèn)為是由兩類不同的化能自養(yǎng)硝化細(xì)菌即:氨氧化細(xì)菌(Ammonium-oxidizing bacteria,英文縮寫為AOB) 和亞硝酸鹽氧化細(xì)菌(Nitrite-oxidizing bacteria,英文縮寫為NOB)完成的[1].到2005年,K?nneke等人發(fā)現(xiàn)氨氧化古菌(Ammonium-oxidizing archaea,英文縮寫為AOA) 在土壤和水生態(tài)系統(tǒng)的硝化過(guò)程中也發(fā)揮著重要作用[2-3].但這仍沒(méi)有改變學(xué)術(shù)界的普遍認(rèn)識(shí)即硝化過(guò)程由氨氧化過(guò)程和亞硝酸鹽氧化過(guò)程等兩步完成.2006年,Costa 等人預(yù)測(cè)理論上存在可進(jìn)行完全硝化的微生物,并將其命名為完全氨氧化菌(COMplete AMMonia OXidizers,以下簡(jiǎn)稱Commamox),但當(dāng)時(shí)這種分工的原因仍不清楚[4].直至近幾年的一些研究富集到了可將氨完全氧化成硝酸鹽的細(xì)菌,該細(xì)菌在系統(tǒng)進(jìn)化上屬于硝化螺菌屬(Nitrospira)譜系II的單一微生物,從而證明了Costa等人提出的假設(shè)[5-8].

Commamox的發(fā)現(xiàn),使學(xué)術(shù)界對(duì)硝化過(guò)程有了一個(gè)全新的認(rèn)識(shí),同時(shí)也引出了如下與硝化作用研究相關(guān)的亟待解決的3個(gè)重要科學(xué)問(wèn)題.首先,Comammox,AOA和AOB均以氨作為能量代謝底物,在同一生境中,這3類微生物之間的關(guān)系如何?其次,尤為重要的是Comammox與傳統(tǒng)的硝化過(guò)程(AOA,AOB和NOB)的生態(tài)位劃分的研究,這對(duì)硝化作用的理解有更重要的意義；最后,Comammox,AOA和AOB代謝過(guò)程中是否釋放N2O及其排放量亦需要重新評(píng)估.基于此,本文擬對(duì)目前Comammox的研究做一回顧,并展望未來(lái)的研究方向.

1 概述

傳統(tǒng)的硝化過(guò)程由兩步完成:氨氧化細(xì)菌和/或氨氧化古菌(Ammonium-oxidizing microorganisms,英文縮寫為AOM).先將氨氧化成亞硝酸鹽,然后由亞硝酸鹽氧化細(xì)菌(NOB)將亞硝酸鹽氧化成硝酸鹽.其中氨氧化微生物(AOM)和NOB主要是化能自養(yǎng)菌,氨和亞硝酸鹽分別是氨氧化微生物和亞硝酸鹽氧化細(xì)菌進(jìn)行自養(yǎng)生長(zhǎng)的唯一能源,不需要任何有機(jī)化合物,僅利用所產(chǎn)生的化學(xué)能就可以維持生存.最近研究發(fā)現(xiàn)的3 種經(jīng)過(guò)富集細(xì)菌(Candidatus nitrospira nitrosa，candidatus nitrospira nitrificans和candidatus nitrospira inopinata)和一種未經(jīng)過(guò)純培養(yǎng)的細(xì)菌(類Nitrospira)[5-7],均具備單獨(dú)將氨氧化為硝酸鹽的能力,這些微生物被定義為完全氨氧化菌(Comammox).目前的研究認(rèn)為,Comammox均屬于硝化螺菌屬(Nitrospira spp).硝化螺菌屬(Nitrospira)至少存在6種系統(tǒng)發(fā)育亞系[9],其中譜系II在自然和工程生態(tài)系統(tǒng)中分布最廣泛,已發(fā)現(xiàn)的Comammox細(xì)菌均屬于硝化螺菌屬譜系Ⅱ[5-7].此外,與傳統(tǒng)的硝化微生物相比,Comammox生長(zhǎng)速度更加緩慢,但是產(chǎn)生的能量更多[4].

2 Comammox分布

Comammox自發(fā)現(xiàn)以來(lái),便受到了廣泛關(guān)注,研究主要集中在不同生態(tài)系統(tǒng)中的生態(tài)學(xué)意義及環(huán)境相關(guān)性方面.基于富集培養(yǎng)的Comammox物種中氨氧化功能基因(如AmoA，AmoB，AmoC和Hao基因),在許多已發(fā)表的數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)環(huán)境樣品進(jìn)行宏基因組篩選,發(fā)現(xiàn)Comammox細(xì)菌在一系列陸地和水生生態(tài)系統(tǒng)中廣泛存在,包括農(nóng)業(yè)土壤、淡水棲息地、污水處理廠(Wastewater Treatment Plants,英文縮寫為WWTPs)和飲用水處理等系統(tǒng)中[5-9].Comammox AmoA基因序列與先前指定的屬于Crenothrix多孢菌的未培養(yǎng)的甲烷氧化菌的甲烷單加氧酶序列高度相似[5-6].因此，基于PCR的研究可能錯(cuò)誤地將Comammox AmoA基因分類為環(huán)境樣品中的Crenothrix PmoA基因[10].基于以上,這些研究結(jié)果提供了強(qiáng)有力的證據(jù),表明Comammox細(xì)菌可能具有比以前更廣泛的環(huán)境分布，并在未來(lái)研究中必須將單步硝化納入這些生態(tài)系統(tǒng)中.以下介紹Comammox在一些主要環(huán)境中的分布情況.

2.1 飲用水系統(tǒng)中Comammox 分布

丹麥飲用水處理廠的擴(kuò)增子測(cè)序和基于qPCR的研究調(diào)查發(fā)現(xiàn),Nitrospira被認(rèn)為在地下水處理的快速砂濾器中起主導(dǎo)作用(占微生物群落的5-10%),其豐度分別比AOB和AOA高出2個(gè)和6個(gè)數(shù)量級(jí)[11-12].鑒于這些Nitrospira都屬于亞系Ⅱ,Comammox種群水平基因組(CG24)[8]也具有較高豐度 (所有映射的宏基因組測(cè)序讀數(shù)的30%),單步硝化很可能發(fā)生在這些快速砂濾器中[11].這與最近的宏基因組學(xué)證據(jù)一致:Comammox細(xì)菌廣泛分布在亞洲和北美的幾個(gè)飲用水系統(tǒng)中[7,9],以及生物過(guò)濾裝置中高豐度Nitrospira[13-14].有趣的是,在消毒的飲用水系統(tǒng)中也觀察到高豐度亞系II硝化菌[15],這突出表明需要評(píng)估Comammox對(duì)供水期間不需要硝化作用的貢獻(xiàn).

2.2 工程系統(tǒng)中Comammox 分布

除了飲用水系統(tǒng)外,Bartelme等[16]人的研究表明,在RAS生物濾池中,Comammox是最豐富的氨氧化劑,其豐度是AOA豐度的1.9倍,比AOB的豐度高出3個(gè)數(shù)量級(jí).此外,在污水處理廠中也發(fā)現(xiàn)了Comammox細(xì)菌[5,17],與活性污泥中Nitrospira的高豐度和微觀多樣性相一致[18].雖然它們?cè)谖鬯幚韽S中的分布情況很大程度上尚未開(kāi)發(fā),但來(lái)自?shī)W地利維也納的一家大規(guī)模水廠的一項(xiàng)研究報(bào)告顯示,Comammox細(xì)菌占硝化螺菌屬種群數(shù)量的43-71%,且豐度高于AOB[5].這些研究均表明Comammox在工程生態(tài)系統(tǒng)中是進(jìn)行硝化的重要參與者,與AOA,AOB和嚴(yán)格的亞硝酸鹽氧化的Nitrospira的多樣化群體相互作用.

2.3 土壤環(huán)境中Comammox 分布

AOB,AOA和Comammox細(xì)菌可能都會(huì)導(dǎo)致土壤中的氨氧化.然而,它們的相對(duì)貢獻(xiàn)很難估計(jì),因?yàn)椴煌沫h(huán)境因素會(huì)影響它們的豐度和活性[19].最近,基于基因組序列研究發(fā)現(xiàn),Comammox細(xì)菌似乎具有廣泛的代謝多樣性,因此,它可能在多種環(huán)境中具有競(jìng)爭(zhēng)力[20].雖然這些觀察結(jié)果是研究耐鹽的Comammox細(xì)菌,但也可預(yù)測(cè)它們與土壤硝化作用的相關(guān)性.實(shí)際上,在多個(gè)(農(nóng)業(yè))土壤宏基因組中發(fā)現(xiàn)了Comammox序列[5-6],并且在稻田土壤中檢測(cè)到約25%的氨氧化劑[21].此外,在森林土壤中也檢測(cè)到Comammox細(xì)菌[22],而且pH值為4.0到9.0的森林土壤都顯示出Comammox的潛力[22].盡管高AmoA基因拷貝數(shù)不一定與氨氧化程度相關(guān),但它仍然突出了Comammox細(xì)菌在土壤中的重要作用.

Comammox細(xì)菌不僅存在以上環(huán)境中,而且在沿海水域[16]、河流沉積物和咸水湖沉積物[21]中也有發(fā)現(xiàn),甚至大氣中的細(xì)顆粒物質(zhì)也是Comammox細(xì)菌的棲息地[23].無(wú)處不在的Comammox細(xì)菌表明它們對(duì)不同生態(tài)系統(tǒng)中的硝化作用都具有潛在的貢獻(xiàn).雖然Comammox在許多環(huán)境中被廣泛發(fā)現(xiàn),但與其他氮循環(huán)微生物的關(guān)系的研究報(bào)道還很少.

3 Comammox系統(tǒng)發(fā)育分析

Comammox 16S rRNA或nxrB基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析表明其不形成單系群,而是穿插在嚴(yán)格的亞硝酸鹽氧化的硝化螺菌屬中[5-7]如圖1(a)所示.因此,使用16S rRNA或nxrB基因的系統(tǒng)發(fā)育分析無(wú)法區(qū)分Comammox與傳統(tǒng)的Nitrospira.由富集物的宏基因組數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn),Comammox編碼的氨單加氧酶(AMO)在進(jìn)化上與傳統(tǒng)的AOB和AOA的氨單加氧酶(AMO)基因不同[5-6]如圖1(b)所示,并且已用于Comammox的分類學(xué)研究.

(a)基于16S rRNA的Nitrospira屬的系統(tǒng)發(fā)育樹.Comammox nitrospira用紅色表示.Nitrospira亞系用羅馬數(shù)字表示.(b)氨/甲烷單加氧酶家族的系統(tǒng)發(fā)育分析.Comammox nitrospira的AmoA蛋白質(zhì)簇顯示為紅色,典型氨氧化劑的AmoA序列顯示為綠色.縮寫:Amo,氨單加氧酶;Emo,乙烷單加氧酶;Hmo,烴/丁烷單加氧酶;Pmo/Pxm,顆粒甲烷單加氧酶.

基于AmoA基因的系統(tǒng)發(fā)育分析認(rèn)為,Comammox nitrospira譜系Ⅱ,包括兩個(gè)分支A和B[5-6](Clade A和Clade B).目前已發(fā)現(xiàn)的Candidatus nitrospira nitrosa,candidatus nitrospira nitrificans 和Candidatus nitrospira inopinata純培養(yǎng)菌均屬第一個(gè)分支(Clade A)[21,24].最近,Pjevac等[21]人針對(duì)Comammox的AmoA基因設(shè)計(jì)了特異性引物,并且這對(duì)引物具有廣泛的覆蓋范圍,已用在實(shí)時(shí)定量PCR方法中,快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)環(huán)境中Comammox的豐度.

4 Comammox與其他氮循環(huán)微生物的關(guān)系

4.1 Comammox與典型的硝化微生物

通過(guò)宏基因組數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)Comammox與AOA和AOB同時(shí)存在農(nóng)業(yè)土壤,淡水棲息地、污水處理廠(WWTPs)和飲用水處理等系統(tǒng)中[5-9,16],說(shuō)明它們理論上是可以共存的.然而,鑒于宏基因組學(xué)和擴(kuò)增PCR分析有一定的局限性,需通過(guò)其他方法如Comammox特異性引物來(lái)確定Comammox細(xì)菌的豐度.目前通過(guò)定量數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn),在森林土壤[22]、大氣顆粒物[23]、循環(huán)水產(chǎn)養(yǎng)殖系統(tǒng)[16]和地下水快速砂濾池[24]中同時(shí)存在Comammox,AOA,AOB和NOB，因前3類微生物均利用NH4+作為能源物質(zhì)，推測(cè)Comammox細(xì)菌和典型的硝化微生物間存在競(jìng)爭(zhēng),但在環(huán)境中可以共存.此外,海洋中AOA對(duì)氨具有很高的親和力,Kits等人研究發(fā)現(xiàn),Nitrospira inopinata對(duì)氨的親和力高于陸地中AOA氨的親和力,AOB對(duì)氨的親和力最低[25],說(shuō)明在陸地土壤中,氨濃度有限的情況下,Comammox是可以競(jìng)爭(zhēng)過(guò)AOA和AOB的.目前在海洋宏基因組中沒(méi)有鑒定到Comammox氨單加氧酶A基因,表明Comammox廣泛分布于除了海洋以外的其他環(huán)境中[5].

雖然Comammox nitrospira inopinata與嚴(yán)格的亞硝酸鹽氧化過(guò)程中的Nitrospira物種(傳統(tǒng)意義上的NOB) 密切相關(guān),但研究發(fā)現(xiàn)，它對(duì)亞硝酸鹽的親和力很差[20].所以,在亞硝酸鹽濃度較低的環(huán)境中,可能不利于它作為嚴(yán)格的亞硝酸鹽氧化細(xì)菌生長(zhǎng).但當(dāng)環(huán)境中適合Comammox nitrospira inopinata生長(zhǎng)時(shí),亞硝酸鹽可在細(xì)胞內(nèi)累積,從而克服了對(duì)亞硝酸鹽親和力差的情況.

4.2 Comammox與Anammox

Van Kessel等[6]人發(fā)現(xiàn),Comammox細(xì)菌可在缺氧條件下與厭氧氨氧化(Anammox) 細(xì)菌形成緊密的共聚集體,表明這些微生物可能是互生而非競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系.推測(cè)Comammox在缺氧條件下通過(guò)氨氧化為厭氧氨氧化細(xì)菌提供底物亞硝酸鹽.需進(jìn)一步通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)這一推測(cè).從而達(dá)到在氮的去除過(guò)程中可以維持這種相互作用的潛在控制策略.盡管它們對(duì)工程和自然生態(tài)系統(tǒng)都具有潛在的重要性,但是Comammox,AOA,AOB和NOB之間的生態(tài)位分離的因素仍然未知.

5 Comammox生態(tài)位

許多研究結(jié)果表明，AOA和AOB在土壤中的相對(duì)貢獻(xiàn)及其生態(tài)位受多種環(huán)境因素的影響,如:氧[27-28],氨[29-30]和pH[31]等.然而,關(guān)于環(huán)境因子對(duì)Comammox的影響還尚不明確.部分研究發(fā)現(xiàn)，Comammox細(xì)菌中Nitrospira nitrificans適合低氨的濃度[5].最近的動(dòng)力學(xué)研究還表明,與土壤AOA和AOB相比,Comammox細(xì)菌中Nitrospira inopinata具有更高的底物親和力[20](見(jiàn)圖2),以上說(shuō)明Comammox細(xì)菌具有更強(qiáng)的攝取底物能力,可能在低氨濃度下具有競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì).此外,基于基因組數(shù)據(jù)分析,Comammox細(xì)菌可能更適應(yīng)低氧或微量氧環(huán)境[5].因此,Comammox可能更適合在低溶解氧濃度下生長(zhǎng),這與Costa等人的發(fā)現(xiàn)一致:Comammox細(xì)菌具有更高的氧的親和力[4].

此外,雖然亞硝酸鹽不是Comammox的直接底物和產(chǎn)物,但它會(huì)影響傳統(tǒng)的氨氧化和亞硝酸鹽氧化過(guò)程,進(jìn)而間接影響Comammox.以前的研究表明,Comammox細(xì)菌廣泛存在于Nitrospira譜系Ⅱ中[5-7],在底物條件限制下,Nitrospira譜系Ⅱ?qū)喯跛猁}和氧氣具有高的親和力,而Nitrospira譜系I具有較低的亞硝酸鹽和氧的親和力,在較高底物濃度下,Nitrospira譜系I才能競(jìng)爭(zhēng)過(guò)Nitrospira譜系Ⅱ[32].因此,這些結(jié)果表明，較低的亞硝酸鹽濃度可能對(duì)Comammox是有益的.綜上所述,Comammox具有廣泛的生態(tài)位.

圖2 氨氧化微生物對(duì)底物親和力[25]Fig.2 Substrate affinities for ammonia-oxidizing microbes[25]

在硝化過(guò)程中,氨通過(guò)亞硝酸鹽氧化成硝酸鹽.硝化過(guò)程的第一步由氨氧化古菌(AOA)和細(xì)菌(AOB)使用氨單加氧酶(Amo)酶(未顯示)催化.相反,Nitrospira inopinata細(xì)菌催化氨完全氧化成硝酸鹽.海洋中AOA對(duì)氨具有很高的親和力.Kits等人研究發(fā)現(xiàn),Nitrospira inopinata對(duì)氨的親和力高于陸地中AOA氨的親和力.AOB對(duì)氨的親和力最低.Nitrospira inopinata被認(rèn)為是通過(guò)水平基因轉(zhuǎn)移過(guò)程即從β蛋白原AOB(β-AOB) 中獲得了高親和力的Amo基因,或?qū)⑵滢D(zhuǎn)移到β-AOB獲得了高親和力的Amo基因.之后該物種可能進(jìn)化出不同程度的氨的親和力.

6 展望

6.1 硝化作用的研究方向

自Comammox發(fā)現(xiàn)以來(lái),在一些循環(huán)水產(chǎn)養(yǎng)殖、飲用水、廢水處理廠以及一系列天然淡水和陸地生態(tài)等系統(tǒng)中都檢測(cè)到了大量的Comammox.雖然這些初步研究結(jié)果強(qiáng)調(diào)了它們對(duì)工程過(guò)程中硝化作用的潛在貢獻(xiàn),但AmoA基因豐度,甚至以及基因表達(dá)并不總是與原位硝化活性相關(guān),正如污水處理廠中的AOA[33].對(duì)于今后Comammox細(xì)菌的研究應(yīng)集中在檢測(cè)Comammox原位活性方面,以更好地確定它們?cè)谔烊缓凸こ滔到y(tǒng)中對(duì)硝化作用和其他養(yǎng)分循環(huán)過(guò)程的功能貢獻(xiàn).此外,了解調(diào)節(jié)Comammox細(xì)菌功能的生態(tài)生理參數(shù)對(duì)于創(chuàng)建新的過(guò)程控制策略以改進(jìn)硝化作用的管理至關(guān)重要.這不僅包括了解環(huán)境參數(shù)(如氧氣和氨的可用性)如何影響Comammox細(xì)菌的行為,還包括Comammox細(xì)菌與其它氮循環(huán)微生物之間的相互作用.這需要將多組學(xué)與生理學(xué)和反應(yīng)器實(shí)驗(yàn)相結(jié)合,以加深對(duì)生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)氮循環(huán)機(jī)制的理解.

6.2 一氧化二氮的研究方向

一氧化二氮(N2O)是一種重要的溫室氣體,目前是二氧化碳(CO2)和甲烷(CH4)之后全球變暖的第3大因素.自然界中N2O的釋放主要由異養(yǎng)反硝化和硝化-反硝化作用引起[34-35].之前有學(xué)者研究表明氨氧化細(xì)菌(AOB)在氨氧化過(guò)程可產(chǎn)生N2O[36-37],近年來(lái),也有報(bào)道AOA的幾種菌株可產(chǎn)生N2O[38-40],然而,在同一環(huán)境中AOA和AOB對(duì)于N2O的產(chǎn)生還很少有報(bào)道.2018年,Hink等人發(fā)現(xiàn)在低氨濃度情況下,氨的去除主要由AOA主導(dǎo),并且只產(chǎn)生少量N2O,相反,在高氨濃度情況下,氨的去除主要由AOB主導(dǎo),與AOA主導(dǎo)過(guò)程相比,會(huì)產(chǎn)生更多的N2O[41].雖然Liu S等[42]人發(fā)現(xiàn)，Comammox細(xì)菌通過(guò)富集培養(yǎng)可產(chǎn)生N2O,但在自然環(huán)境中Comammox是否產(chǎn)生N2O仍然未知.因此,未來(lái)的研究不僅應(yīng)關(guān)注氨氮損失的影響,還應(yīng)關(guān)注自然生態(tài)系統(tǒng)中N2O的釋放,這將對(duì)全球氨氮施肥管理和N2O預(yù)算通量產(chǎn)生重要影響.