陳芝華 李夢璐 呂偉旗 湯晟凌

使君子Quisqualis indica L.果實中含有多種生物堿、脂肪油、氨基酸、單寧、甾體類等[1-4]，具有驅(qū)蟲、抑菌、抗病毒、保護肝臟等作用[5-6]。我國使君子分布區(qū)與引種栽培地域較廣，不同地區(qū)經(jīng)緯度、海拔等生境因子存在差異，導(dǎo)致使君子藥材質(zhì)量參差不齊，影響使君子藥材市場健康發(fā)展[7]。生物堿類是使君子的主要活性成分之一，其代表化合物葫蘆巴堿是2015版《中國藥典》規(guī)定的使君子質(zhì)量評價指標(biāo)。筆者收集了我國主分布區(qū)廣西、廣東、福建、四川、云南等8省18份使君子果實野生資源，優(yōu)化高效液相色譜法（HPLC）測定果實中葫蘆巴堿含量，并分析其與種源地海拔、經(jīng)緯度，果實生長性狀間相關(guān)性，以期為使君子優(yōu)良種源篩選、藥材質(zhì)量評價提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥 材 2017年9月—2017年10月，收集廣西、廣東、福建、四川、云南等8省18份使君子果實野生資源，經(jīng)我院湯晟凌副主任藥師鑒定為使君子科植物使君子Quisqualis indica L.的新鮮成熟果實，種質(zhì)資源信息詳見表1。

1.2 儀器與試劑 1260型高效液相色譜儀（美國Aglient公司）；Milli-Q Academic超純水儀（美國Millipore公司）；DGG-9070電熱恒溫鼓風(fēng)干燥器（上海森信試驗儀器有限公司）；PTY-124/223型電子分析天平（上海諾萱科學(xué)儀器有限公司）；800DTD型超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；JP-150A-8型手提式小型中藥粉碎機（永康市久品工貿(mào)有限公司）。葫蘆巴堿對照品（批號STB260-201701）購于北京索萊寶科技有限公司；乙腈為色譜純（北京京科瑞達科技有限公司，批號2017-40064193）；甲醇（批號10014108-201707）、乙醇（批號80176961-201708）、磷酸二氫鈉（批號 20040818-201612）等均為分析純（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）。

表1 供試使君子種源信息

1.3 方法

1.3.1 果實生長性狀測定 每個種源隨機取20個果實，用游標(biāo)卡尺測量果實縱徑、橫徑，計算果形指數(shù)=果實縱徑/果實橫徑。將測量后的果實去除外果殼，取出種子，60℃烘箱烘至恒重，粉碎過60目篩，待用。

1.3.2 色譜條件 Spherisorb SCX（4.6mm×150mm，5μm）；流動相乙腈—0.2%磷酸二氫鈉（V∶V=78∶22），等度洗脫；體積流量1.0mL/min；檢測波長265nm；柱溫 25℃；進樣量 20μL。

1.3.3 線性關(guān)系考察 精密稱取葫蘆巴堿對照品適量，加70%甲醇配制成濃度為0.1192mg/mL的對照品溶液，取 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mL 對照品溶液至10mL容量瓶，70%甲醇定容，取適量過0.45μm微孔濾膜，按“1.3.2”項色譜條件下進樣，測定葫蘆巴堿峰面積，以峰面積Y為縱坐標(biāo)，濃度X為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。本試驗葫蘆巴堿線性方程為Y=88.22X－8.52，R2=0.9996，表明使君子果實中葫蘆巴堿在1.192～7.152μg/mL的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 加樣回收率試驗（n=3）

1.3.4 供試品含量測定 精密稱取樣品粉末0.3g，加70%甲醇50mL，稱重，密封，30℃條件下超聲提?。üβ?50W，頻率 33kHz）30min，補足差重，精密吸取提取液1.0mL，70%甲醇補足至10mL，取適量，過0.45μm微孔濾膜，按“1.3.2”項色譜條件下進樣，測定葫蘆巴堿峰面積，按“1.3.3”項線性方程計算含量。

1.3.5 精密度試驗 取對照品溶液，按“1.3.2”項色譜條件下連續(xù)進樣6次，測定對照品溶液葫蘆巴堿含量相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）值為0.67%，表明儀器精密度良好。

1.3.6 重復(fù)性試驗 隨機取S14樣品6份，按“1.3.4”項測定樣品葫蘆巴堿含量，得樣品中平均葫蘆巴堿含量為0.26%，RSD值為1.93%，表明試驗重復(fù)性良好。

1.3.7 穩(wěn)定性試驗 隨機取S9樣品，按“1.3.4”項制備供試品溶液，在室溫避光條件下放置 0、3、6、9、12、15、18、24h，按“1.3.2”項色譜條件下進樣，測定 S9 樣品葫蘆巴堿峰面積RSD值為1.34%，表明供試品溶液在室溫避光保存24h內(nèi)穩(wěn)定。

1.3.8 加樣回收率試驗 隨機取S11樣品適量，加適量葫蘆巴堿對照品，按“1.3.4”項測定樣品葫蘆巴堿含量。計算加樣回收率（%）=（C-A）/B×100%，A 為該樣品中葫蘆巴堿含量，B為加入葫蘆巴堿對照品含量，C為實際測得樣品中含有量，試驗平行3次，平均加樣回收率與RSD值見表2。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0、DPS9.05與EXCEL2010軟件處理數(shù)據(jù)，采用單因素方差（ANOVA）分析，聚類分析采用類平均法（UPGMA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC方法優(yōu)化 對葫蘆巴堿HPLC色譜峰進行全波長掃描，結(jié)果表明使君子葫蘆巴堿在265nm處有較大吸收值，故選擇265nm為本試驗葫蘆巴堿測定波長。在2015版《中國藥典》基礎(chǔ)上，對使君子葫蘆巴堿提取工藝進行了優(yōu)化，分別考察了甲醇濃度（50%、60%、70%、80%）、提取溫度（25℃、30℃、35℃）、提取時間（20min、30min、40min）對葫蘆巴堿含量的影響，結(jié)果表明使君子葫蘆巴堿在70%甲醇作為溶劑，30℃超聲（功率250W，頻率33kHz）30min即可提取完全。同時，考察了流動相甲醇—水、乙腈—水、乙腈—磷酸鹽，發(fā)現(xiàn)以乙腈—磷酸二氫鈉（0.2%）（V∶V=78∶22）為流動相，在色譜柱 Spherisorb SCX（4.6mm×150mm，5μm)，體積流量 1.0mL/min，柱溫25℃，進樣量20μL的色譜條件下，等度洗脫效果較好，葫蘆巴堿理論塔板數(shù)大于4000，分離度大于1.5，色譜圖見圖1。

圖1 HPLC色譜圖

2.2 使君子果實生長性狀與葫蘆巴堿含量比較 使君子果實生長性狀、葫蘆巴堿含量存在顯著差異（P＜0.05）。18個種源使君子葫蘆巴堿平均含量為0.37%，其中云南麗江種源含量最高，為0.54%，四川自貢種源含量最低，為0.26%；果實平均縱、橫徑分別為3.29cm、1.89cm，其中廣東佛山果實最大，縱、橫徑分別為3.89cm、2.21cm，而云南麗江種源果實最為狹長，果形指數(shù)為2.02，見表3。結(jié)果表明，使君子果實生長性狀、葫蘆巴堿含量具有較好的多樣性，有利于使君子優(yōu)良種源篩選。

表3 不同種源使君子果實生長性狀與葫蘆巴堿含量比較

2.3 相關(guān)性分析 供試使君子果實中葫蘆巴堿含量與果實生長性狀、生境因子間關(guān)系密切，與果形指數(shù)、海拔呈正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)分別為0.7421、0.7759；與果實縱徑、果實橫徑、經(jīng)度、緯度呈負相關(guān)關(guān) 系 ， 相 關(guān) 系 數(shù) 分 別 為 0.4122、0.6302、0.5691、0.3022，見表4。結(jié)果表明，高海拔、低經(jīng)緯度地區(qū)栽培有利于使君子果實中葫蘆巴堿含量積累。

2.4 聚類分析 以使君子果實生長性狀與葫蘆巴堿含量為主要指標(biāo)，按照歐氏距離D2=0.44的分類水平，將18個使君子種源劃分4個類群（圖2）。其中，類群Ⅰ共9個種源，分別為廣西桂林、廣西南寧、廣西北海、江西南昌、湖南岳陽、四川自貢、福建泉州、四川成都與福建廈門，該類群以廣西、四川種源為主，果實較大而寬胖，果實中葫蘆巴堿含量中等或較低；類群Ⅱ共6個種源，分別為湖南長沙、江西九江、貴州遵義、福建福州、云南昆明與貴州貴陽，該類群種源組成較雜，果實大小中等而多狹長，果實中葫蘆巴堿含量較高；類群Ⅲ共2個種源，分別為廣東佛山與廣東深圳，該類群使君子果實較大，葫蘆巴堿含量中等；類群Ⅳ僅1個種源，為云南麗江，該種源采集地海拔高（2384m），果實較小而狹長，但果實中葫蘆巴堿含量高。

圖2 不同種源使君子聚類分析圖

3 討論

近年來由于西藥驅(qū)蟲的發(fā)展，使君子的藥用需求逐漸減少，很多傳統(tǒng)產(chǎn)區(qū)的使君子已面臨滅絕[8]。本試驗結(jié)果顯示，18份使君子種源果實中葫蘆巴堿含量存在顯著差異（P＜0.05），平均葫蘆巴堿含量為0.37%，滿足2015版《中國藥典》不低于0.20%的標(biāo)準(zhǔn)。從果實中葫蘆巴堿含量看，我國主分布區(qū)使君子果實葫蘆巴堿含量具有較好的多樣性，藥材質(zhì)量較好，有利于使君子藥材資源利用與良種選育。

植物特別是藥用植物在長期與生態(tài)環(huán)境，包括生物性環(huán)境因子（微生物、昆蟲、大型食草動物）與非生物性環(huán)境因子（海拔、光照、溫度、水、土壤）的博弈中，逐漸形成了一套生態(tài)適應(yīng)性的防御刺激系統(tǒng)，通過電子信號的傳遞，防御基因的上調(diào)表達，次生代謝產(chǎn)物合成途徑關(guān)鍵酶的激活，最終合成相關(guān)次生代謝產(chǎn)物抵御外界脅迫[9-11]。本試驗結(jié)果顯示，種源、果實生長性狀、海拔、經(jīng)緯度顯著影響使君子果實中葫蘆巴堿含量積累；聚類分析顯示，18個使君子種源可劃分4個類群，其中類群Ⅱ與類群Ⅳ使君子果實中葫蘆巴堿含量較高；供試使君子同一種源地藥材多數(shù)聚類在同一類群，表明地理隔離是影響使君子藥材中葫蘆巴堿含量變異的主要因素之一；18個種源中，云南、貴州、廣西、江西種源葫蘆巴堿含量相對較高，廣東、湖南、福建種源含量次之，四川種源含量較低；相關(guān)性分析顯示，葫蘆巴堿含量與果形指數(shù)、海拔呈正相關(guān)關(guān)系，與果實縱徑、果實橫徑、經(jīng)度、緯度呈負相關(guān)關(guān)系。在藥用植物生長發(fā)育過程中，環(huán)境中各因子間存在相互影響與關(guān)聯(lián)[12]，本試驗對不同區(qū)域的海拔與使君子葫蘆巴堿含量進行了初步考察，下一步將在優(yōu)良種質(zhì)篩選的基礎(chǔ)上，開展同一產(chǎn)地內(nèi)不同海拔對使君子葫蘆巴堿含量積累的影響分析，以減少環(huán)境因子間互作關(guān)聯(lián)性的影響。從葫蘆巴堿含量看，在高海拔、低經(jīng)緯度地區(qū)栽培使君子有利于葫蘆巴堿含量積累，而篩選使君子優(yōu)良種源時，可優(yōu)先考慮高果形指數(shù)的云南、貴州、廣西與江西種源。

表4 使君子葫蘆巴堿含量相關(guān)性分析