國巍 燕紅 裴蕾

摘 要：以共固定化菌絲球的產(chǎn)酶能力作為指標，將木質(zhì)素降解菌G13和纖維素降解菌X1012進行共固定，探討了X1012的接入時間、接種量、pH值、搖床的轉速和溫度對菌絲成球和產(chǎn)木質(zhì)纖維素酶的影響。結果表明，當G13與X1012同時接入、纖維素降解菌的接種量為20mL（100mL培養(yǎng)基），培養(yǎng)基的pH值為5、搖床轉速為160r/min、溫度為28℃時，錳過氧化物酶、漆酶、木質(zhì)素過氧化物酶、纖維素酶和半纖維素酶的酶活達到最高，分別為31.246U/L、16.048U/L、157.528U/L、197.063U/L和215.81U/L。X1012與G13在共固定過程中，具有互補的性能，在產(chǎn)酶的過程中發(fā)揮了協(xié)同的作用，促進了木質(zhì)素降解酶的分泌。所獲得的雙菌共生菌絲球的球體為白色，表面光滑，大小均勻，具有一定的機械強度，能夠滿足實踐應用的需求。

關鍵詞：菌絲球；木質(zhì)素降解菌；纖維素降解菌；木質(zhì)素酶；纖維素酶

DOI：10.15938/j.jhust.2018.04.024

中圖分類號： Q939.9

文獻標志碼： A

文章編號： 1007-2683（2018）04-0127-06

Abstract：In our research， enzyme production ability of immobilization mycelial pellet was used as an index， the immobilization mycelial pellet was immobilized with lignindegrading fungus G13 and cellulosedegrading bacteria X1012. The influence of five factors （addition time， inoculation amount of cellulosedegrading bacteria， pH， temperature and rotational speed） to Mycelium pellet， ligninase production and cellulase production were studied. The results indicated that X1012 and G13 were added simultaneously and the inoculation amount was 20%， pH was 5， culture temperature was 28℃， rotational speed was 160 r/min， the manganese（MnP）； laccase（Lac）； lignin peroxidase（Lip）； cellulose； hemicellulose were 31.246U/L；16.048U/L；157.528U/L；197.063U/L；215.81U/L， respectively. X1012 and G13 have the complementary advantage on the immobilization process， develope the synergy effects and promote the production of ligninase. The immobilization mycelial pellet was white， smooth surface， uniform size and good elasticity， which can satisfy practical needs.

Keywords：mycelia pellets；lignindegrading fungus； cellulosedegrading bacteria； ligninase； cellulase

0 引 言

制漿造紙工業(yè)每年要從植物中分離出大約14億t纖維素[1]，同時產(chǎn)生含有5000萬t左右木質(zhì)素的污水[2，3]。木質(zhì)素的結構復雜，降解困難，近年來固定化微生物技術降解木質(zhì)素在制漿造紙工業(yè)廢水處理上有了越來越多的應用[4-6]。固定化微生物技術具有微生物密度高，反應迅速，微生物不易流失，產(chǎn)物易分離等優(yōu)點，是一種低耗能高效率的新技術。菌絲球是由菌絲相互纏繞而成的球體，菌絲球具有生存能力強、沉降速度快、易于固液分離、可重復利用、多孔表面積大的特點[7]。目前國內(nèi)外主要著重研究單一菌株菌絲球的成球機理[8-14]，而造紙廢水是一個非常復雜的混合體系，單一菌株很難達到既凈化水質(zhì)又降解多種廢棄物的目的。本研究將能降解木質(zhì)素的煙曲霉菌G13培養(yǎng)成菌絲球作為生物質(zhì)載體，固定具有降解纖維素能力的蠟樣芽孢桿菌X1012，形成兼具木質(zhì)素和纖維素降解能力的復合菌菌絲球，為造紙廢水處理提供新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來源

可降解木質(zhì)素的煙曲霉菌G13和可降解纖維素的蠟樣芽孢桿菌X1012均來自實驗室前期分離篩選并保存的菌種。

1.1.2 培養(yǎng)基

1）PDA培養(yǎng)基： 去皮馬鈴薯200g，葡萄糖20g/L，KH2PO4 3g/L，MgSO4.7H2O 1.5g/L，瓊脂20g/L，微量VB1，加蒸餾水配成1000mL，pH值自然，120℃滅菌20min。

2）液體培養(yǎng)基： NH4Cl 1g/L，KH2PO4 1g/L，MgSO4.7H2O 0.5g/L，蔗糖10g/L，加蒸餾水配成1000mL，pH值自然，120℃滅菌20min。

3）菌絲球成球培養(yǎng)基：蔗糖18g/L， 酒石酸銨2.5g/L， KH2PO4 2g/L， MgSO4.7H2O 2g/L， 加蒸餾水配成1000mL，pH值自然，120℃滅菌20min。

1.1.3 實驗儀器

SWCJ1FD型超凈工作臺（上海博迅）、HP9052MBE型恒溫培養(yǎng)箱（上海博迅）、THZ92A型汽浴恒溫振蕩箱（上海博迅）、立式壓力蒸汽滅菌器（上海博迅）、T6新世紀紫外可見分光光度計（北京普析通用）、TGL15B型離心機（上海安亭）、S3400N型掃描電鏡（日立）。

1.2 方法

1.2.1 菌懸液的制備

煙曲霉菌菌懸液：將保藏于4℃的煙曲霉菌固體斜面取出，用接種環(huán)將霉菌孢子刮下，接入無菌水中，制成濃度為1×106 個/mL（血球計數(shù)法測定）的孢子懸液，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

蠟樣芽孢桿菌菌懸液：將保藏于4℃的蠟樣芽孢桿菌固體斜面取出，用接種環(huán)刮下其斜面培養(yǎng)物，接入無菌水中，制成濃度為5×106個/mL（血球計數(shù)法測定）的蠟樣芽孢桿菌菌懸液，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 煙曲霉菌菌絲球載體的制備

取5mL煙曲霉菌菌懸液，接入到含100mL菌絲球成球培養(yǎng)液的250mL錐形瓶中，于160r/min，30℃的搖床中振蕩培養(yǎng)3d。過濾收集菌絲球，放入無菌的生理鹽水中，備用。

1.2.3 各種木質(zhì)素酶活力的測定

1）粗酶液的制備。

發(fā)酵液在6000r/min，4℃下離心10min，所得的上清液為粗酶液。

2）錳過氧化物酶活力測定。

向反應體系中加入3.4mL乙酸-乙酸鈉緩沖溶液（濃度為200mmol/L、pH值為4.5），加入0.1mL 1.6mmol/L的MnSO4溶液和0.4mL的粗酶液，最后加入0.1mL 1.6mmol/L的H2O2溶液啟動反應，在37℃下反應3min，測定240nm的吸光度值。一個酶活單位（U）：每分鐘氧化1μmol Mn2+成為Mn3+ 的需酶量。每個樣品平行操作三次，然后取平均值[15]。

3）木質(zhì)素過氧化物酶活力測定。

反應液中含1mL 15mmol/L藜蘆醇溶液、1.5mL酒石酸鈉緩沖液（濃度為250mmol/L、pH值為3）和0.4mL粗酶液，最后加入0.1mL 20mmol/L H2O2溶液啟動反應，在30℃下反應2min，測定310nm下的吸光度值。一個酶活單位（U）：每分鐘氧化1μmol藜蘆醇成為藜蘆醛的需酶量。每個樣品平行操作三次，然后取平均值[16]。

4）漆酶活力測定。

向反應體系中加入2mL乙酸-乙酸鈉緩沖溶液（濃度為200mmol/L、pH值為5）、0.5mL 0.5mmol/L的ABTS溶液和0.5mL粗酶液。在28℃條件下反應10min后，測定600nm下的吸光度值。一個酶活單位（U）：每分鐘使1μmolABTS轉化為ABTS自由基所需的量。每個樣品平行操作三次，然后取平均值[17-18]。

5）纖維素酶活力的測定。

向反應體系中加入1mL用0.2mol/L pH4.8的醋酸緩沖液配制的0.5%的CMCNa溶液，加入1mL適當稀釋的酶液，于50℃反應30min后，加入2mL DNS試劑終止反應，沸水浴中煮沸5min，冷水冷卻后測定530nm 的吸光度值。一個酶活單位（U）：酶活力均扣除發(fā)酵液和各種酶活測定中的底物所含的糖，以葡萄糖作標準溶液，以每分鐘生成1mol葡萄糖作為一個酶活單位。每個樣品平行操作3次，然后取平均值[19-20]。

6）半纖維素酶活力的測定。

向反應體系中加入1mL用0.2mol/L pH4.8的醋酸緩沖液配制的1%的木聚糖溶液，加入1mL適當稀釋的酶液，于50℃反應30min后，加入2mL DNS試劑終止反應，沸水浴中煮沸5min，冷水冷卻后測定530nm吸光度值。一個酶活單位（U）：酶活力的計算應扣除發(fā)酵液和底物所含的糖，以木糖作標準溶液，以每分鐘生成1mol木糖作為一個酶活單位。每個樣品平行操作三次，然后取平均值[21-22]。

1.2.4 菌絲球直徑的測量

將20個菌絲球在平板上排成一排，用濾紙吸干表面水分，用直尺測總長再取平均值即為一個菌絲球的直徑。

1.2.5 菌絲球產(chǎn)酶條件優(yōu)化

以共固定化菌絲球的產(chǎn)酶能力作為指標，考察了X1012的接入時間、X1012的接種量、培養(yǎng)液pH值、培養(yǎng)溫度和搖床轉速五個因素，確定復合菌菌絲球的最佳成球條件。

1.2.6 菌絲球形態(tài)觀察

將X1012與G13接入到100 mL（250 mL錐形瓶）成球培養(yǎng)基中，采用優(yōu)化后的最佳培養(yǎng)條件培養(yǎng)，當形成菌絲球后，將其取出并用生理鹽水沖洗，放置在培養(yǎng)皿中，觀察其外觀形態(tài)，用掃描電子顯微鏡（2 300倍）觀察其內(nèi)部形態(tài)。

2 結果與討論

本研究將煙曲霉菌G13菌絲球作為固定化載體用于固定蠟樣芽孢桿菌X1012，形成的固定化菌絲球既具有木質(zhì)素降解能力，又有很強的纖維素降解活力，可應用于實際造紙廢水處理。

2.1 X1012接入時間對復合菌菌絲球產(chǎn)酶的影響

將G13先接入到100 mL（250 mL錐形瓶）成球培養(yǎng)基中，接種量為5 mL，X1012以五種不同的時間接入，分別為：與G13同時接入、在G13培養(yǎng)的第1、2、3、4 d接入。接種量為10 mL，于160 r/min，30℃的搖床中振蕩培養(yǎng)，每隔2 d取樣測錳過氧化物酶、漆酶、木質(zhì)素過氧化物酶、纖維素酶、半纖維素酶，測得不同接入時間下菌絲球的五種酶活的最大值見表1。

如表1所示，X1012的接入時間不同，菌絲球的木質(zhì)纖維素酶活都有著明顯的差別。隨著接入時間的滯后，錳過氧化物酶、漆酶、木質(zhì)素過氧化物酶、纖維素酶、半纖維素酶都有減小的趨勢，同時接入G13和X1012，X1012會快速被不斷生長的菌絲吸附并緊密纏繞，形成的菌絲球球徑均一彈性好，此時的錳過氧化物酶、漆酶、木質(zhì)素過氧化物酶、纖維素酶、半纖維素酶的酶活均為最大，分別為4.689U/L、0.273U/L、17.437U/L、80.046U/L和108.52U/L。因此煙曲霉菌和蠟樣芽孢桿菌同時接入培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，最有利于復合菌絲球形成和產(chǎn)酶。

2.2 接種孢子濃度對產(chǎn)酶的影響

將X1012與G13同時接入到100mL（250mL錐形瓶）成球培養(yǎng)基中，G13的接種量為5mL，X1012的接種量分別為5、10、15、20、30mL和40mL。于160r/min，30℃的搖床中振蕩培養(yǎng)，每隔2d取樣測錳過氧化物酶、漆酶、木質(zhì)素過氧化物酶、纖維素酶、半纖維素酶，測得各接種孢子濃度下菌絲球的五種酶活的最大值見表2。

菌絲球直徑的大小隨著X1012接種量的增加而變大，當接種量超過20%時，菌絲球變的大而軟，彈性非常差，不適合應用于造紙廢水處理。由表2可以看出，當X1012的接種量為20%時，錳過氧化物酶、木質(zhì)素過氧化物酶、纖維素酶和半纖維素酶的酶活均為最高，分別為11.242U/L、27.017U/L、115.364U/L和169.837U/L，此時菌絲球的直徑約為4.15mm。因此當X1012的接種量為20%時，最有利于復合菌絲球形成和產(chǎn)酶。

2.3 pH值對產(chǎn)酶的影響

將X1012與G13同時接入到100mL（250mL錐形瓶）成球培養(yǎng)基中，G13的接種量為5mL，X1012的接種量為20mL。調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值，使其分別為2、3、4、5、6、7、8和9。于160r/min， 30℃的搖床中振蕩培養(yǎng)，每隔2d取樣測錳過氧化物酶、漆酶、木質(zhì)素過氧化物酶、纖維素酶和半纖維素酶，測得各pH值下五種酶活的最大值見表3。

pH值能影響微生物表面帶電基團的解離，并且會影響營養(yǎng)物質(zhì)的吸收以及代謝產(chǎn)物的分泌。由表3可以看出，培養(yǎng)液的pH值對復合菌成球的影響很大，當培養(yǎng)液的pH值為2、8、9時，培養(yǎng)基均成呈淡黃色，并且渾濁，說明過酸或過堿均不適合菌體的生長，不能成球。隨著培養(yǎng)液pH值的增加，發(fā)酵液中的酶活也隨之增加，當培養(yǎng)液的pH值為5時，五種酶的活性均達到最高值，分別為12.565、3.837、108.306、164.908U/L和205.801U/L。當培養(yǎng)液的pH值超過5時，酶活力都有所下降。因此得出結論，復合菌菌絲球適合在中性偏酸的環(huán)境下生長，當培養(yǎng)液的pH值為5時，最有利于復合菌菌絲球的形成和產(chǎn)酶。

2.4 溫度對產(chǎn)酶的影響

將X1012與G13同時接入到100mL（250mL錐形瓶）成球培養(yǎng)基中，G13的接種量為5mL，X1012的接種量為20mL，培養(yǎng)基pH值為5。于160r/min，溫度分別為24、28、30、34℃和37℃的搖床中振蕩培養(yǎng)，每隔2d取樣測錳過氧化物酶、漆酶、木質(zhì)素過氧化物酶、纖維素酶和半纖維素酶，測得各溫度下五種酶活的最大值見表4。

表4表明，24℃時五種酶的活性最低，當溫度為28℃時，錳過氧化物酶、漆酶、木質(zhì)素過氧化物酶三種木質(zhì)素降解酶的活性最高，分別為16.669U/L、4.763U/L和145.912U/L，比24℃時提高了近50%。當溫度超過28℃，三種木質(zhì)素降解酶活性均有下降趨勢，反之纖維素酶活則明顯升高，在30℃時達到最大（265.226U/L），半纖維素酶活在34℃時達到最大（235.212U/L）。據(jù)此可知，復合菌菌絲球不適宜在低溫下生長，產(chǎn)酶活力低。綜合考慮實際工程中經(jīng)濟能源等影響因素，選擇28℃為復合菌菌絲球成球和產(chǎn)酶的最佳溫度。

2.5 搖床轉速對產(chǎn)酶的影響

將X1012與G13同時接入到100mL（250mL錐形瓶）成球培養(yǎng)基中，G13的接種量為5mL，X1012的接種量為20mL，培養(yǎng)基pH值為5。于轉速分別為120、140、160r/min和180r/min，28℃的搖床中振蕩培養(yǎng)，每隔2d取樣測錳過氧化物酶、漆酶、木質(zhì)素過氧化物酶、纖維素酶和半纖維素酶，測得各轉速下5種酶活的最大值見表5。

表5為搖床轉速對復合菌產(chǎn)酶的影響。剪切力不僅能夠促進介質(zhì)中氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)的傳遞，而且能夠促進菌絲尖端的生長，纏繞成菌絲球。但是剪切力太小會影響物質(zhì)在介質(zhì)中的轉移，菌絲得不到足夠的營養(yǎng)，不足以支撐菌絲的生長；而剪切力太大

會增加菌絲的生長阻力和磨損阻力。隨著搖床轉速的增大，發(fā)酵液中酶活的值先增大后減小，轉速為160r/min時形成的剪切力最有利于復合菌菌絲球的生長，此時錳過氧化物酶、漆酶、木質(zhì)素過氧化物酶、纖維素酶、半纖維素酶五種酶的酶活分別為17.851、4.847、149.548、157.463U/L和171.253U/L。因此，當轉速為160r/min時，最有利于復合菌菌絲球的成球和產(chǎn)酶。

2.6 培養(yǎng)時間對產(chǎn)酶的影響

將X1012與G13同時接入到100mL（250mL錐形瓶）成球培養(yǎng)基中，G13的接種量為5mL，X1012的接種量為20mL，培養(yǎng)基pH值為5。于160r/min， 28℃的搖床中振蕩培養(yǎng)。每隔8h取樣，在600nm下測定培養(yǎng)液中上清液的吸光度，結果如圖1所示。每d取樣測量菌絲球的直徑和錳過氧化物酶、漆酶、木質(zhì)素過氧化物酶、纖維素酶、半纖維素酶，結果如圖4和圖5所示。

由圖1可知，菌絲球成球培養(yǎng)液的吸光度整體趨勢是隨著培養(yǎng)時間的延長而下降的。0-40h吸光度值下降得很緩慢，培養(yǎng)到16h時吸光度值突然變大，這是因為在培養(yǎng)初期細菌X1012大量生長繁殖，而真菌孢子形成菌絲的過程相對緩慢，X1012的生長速度大于G13形成菌絲的速度，所以吸光度變大。當培養(yǎng)時間為96h時，吸光度降至最低，僅為0.083，此時培養(yǎng)基不再渾濁，這說明G13在形成菌絲球的過程中已將X1012固定，形成混合菌絲球。由圖2可以觀察到所形成的復合菌絲球大小均勻，表面光滑，直徑平均約為4.35mm。將混合菌絲球切開，利用掃描電鏡（2300倍）觀察其內(nèi)部結構，在圖3中可以看到菌絲球內(nèi)部空間孔穴內(nèi)有大量菌體，說明纖維素降解菌X1012已被很好的固定。菌絲球由菌絲體纏繞而成，內(nèi)部呈現(xiàn)出空間網(wǎng)狀結構，具有多孔表面積大的特點，非常適合作固定化載體。

從圖4可以看出，復合菌在第2d開始成小顆粒菌絲球，隨著培養(yǎng)時間的增長，菌絲球的直徑呈增大的趨勢，培養(yǎng)到第4d，菌絲球的直徑最大，平均約為4.35mm，此后菌絲球的直徑基本不變。培養(yǎng)至第12d，菌絲球的機械強度變差，培養(yǎng)基開始逐漸渾濁。第15d開始，菌絲球開始出現(xiàn)自溶現(xiàn)象。培養(yǎng)時間對復合菌菌絲球產(chǎn)酶的影響如圖5所示，錳過氧化物酶、漆酶、木質(zhì)素過氧化物酶的酶活都是先增大后減小，木質(zhì)素過氧化物酶、錳過氧化物酶和漆酶活性分別在第4d、第6d和第7d達到最大，酶活分別為157.528U/L、31.246U/L和16.048U/L。纖維素酶和半纖維酶的酶活都是隨著培養(yǎng)時間的增長而減小，并且均在第3d達到最大，分別為197.063U/L和215.81U/L。 在前期的工作中，將5mL煙曲霉菌菌懸液接種于100mL（250mL錐形瓶）產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，于160r/min，28℃的搖床中振蕩培養(yǎng)5d，取樣后測得錳過氧化物酶、漆酶、木質(zhì)素過氧化物酶的酶活分別為8.271U/L、0.95U/L和13.553U/L，明顯低于復合菌菌絲球產(chǎn)生的三種木質(zhì)素降解酶的酶活。據(jù)此可以得出結論，纖維素降解菌X1012與木質(zhì)素降解菌G13具有互補的性能，在產(chǎn)酶的過程中發(fā)揮了協(xié)同的作用，促進了木質(zhì)素降解酶的分泌。

3 結 論

1）通過考察不同因素對復合菌菌絲球產(chǎn)酶及成球的效果發(fā)現(xiàn)，復合菌菌絲球在酸性和高溫的環(huán)境下仍能成球和產(chǎn)酶。在產(chǎn)酶的過程中，纖維素降解菌X1012與木質(zhì)素降解菌G13發(fā)揮了協(xié)同的作用。X1012與G13同時接入、共同培養(yǎng)4d，復合菌的成球效果最佳。

2）菌絲球內(nèi)部由大量菌絲纏繞而成，具有多孔表面積大的特點，這些特點非常符合固定化技術對載體的需求。雙菌共固定化菌絲球生長穩(wěn)定，產(chǎn)酶高效，形成的菌絲球大小均一，具有一定的機械強度，可進一步滿足處理造紙廢水的需要。

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（編輯：王 萍）