于文萃，高毓?jié)?，于鳳斌

(1.遼寧地質(zhì)工程職業(yè)學院，丹東 118000；2.丹東市藥品檢驗檢測中心，丹東 118002)

小檗堿甲氧芐啶膠囊為復方制劑，主要成分為鹽酸小檗堿和甲氧芐啶，體外實驗證實[1]，鹽酸小檗堿對多種革蘭氏陽性及陰性菌均有抑制作用，其中對溶血性鏈球菌、金黃色葡萄球菌、霍亂弧菌、志賀菌屬、腦膜炎奈瑟菌、白喉桿菌和傷寒桿菌等的抑制作用較強。甲氧芐啶[2]干擾細菌葉酸代謝，選擇性抑制二氫葉酸還原酶和核酸的合成。二者組成復方制劑的抗菌作用較單藥增強，耐藥菌株減少，臨床用于敏感菌所致的胃腸炎和細菌性痢疾等腸道感染疾病?，F(xiàn)行質(zhì)量標準[3]對其組分鹽酸小檗堿、甲氧芐啶分別采用HPLC法和紫外分光光度法進行含量測定，步驟繁瑣，操作不便，樣品消耗量大，為了提高檢驗效率，簡化質(zhì)量標準，本文參考相關文獻[4-7]，首次利用HPLC法建立了同時測定小檗堿甲氧芐啶膠囊中鹽酸小檗堿和甲氧芐啶含量的方法，該方法簡便、快速、準確、重復性好。

1 儀器與試藥

1.1儀器 島津LC-10AT高效液相色譜系統(tǒng)，島津SPD-10A(UV-Vis Detector)，島津Labsolution 色譜工作站[島津(中國)有限公司]；SK8200HP超聲波清洗儀(上海科導超聲儀器有限公司)；JJ500型精密電子天平(常熟雙杰測試儀器廠)；XS-205十萬分之一電子天平(瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司)。

1.2試藥 鹽酸小檗堿對照品(批號110713-201212，質(zhì)量分數(shù)86.7%)，甲氧芐啶對照品(批號100031-201606，質(zhì)量分數(shù)99.8%)，均購自中國食品藥品檢定研究院；小檗堿甲氧芐啶膠囊(每粒含鹽酸小檗堿100 mg，甲氧芐啶50 mg)為市售；磷酸二氫鉀(分析純，天津市福晨化學試劑廠)；甲醇、乙腈(色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司)；水為自制去離子超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1對照品溶液的制備 分別取鹽酸小檗堿和甲氧芐啶對照品23.13和10.37 mg，置于同一100 mL量瓶中，用體積分數(shù)為1%的鹽酸和50%的甲醇溶液溶解，稀釋至刻度，搖勻，作為對照品儲備液，取上述儲備液5.0 mL，置于25 mL量瓶中，用體積分數(shù)為1%的鹽酸和50%的甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，制成質(zhì)量濃度分別為40.11和20.70 μg·mL-1的鹽酸小檗堿和甲氧芐啶的混合對照品溶液。

2.2供試品溶液的制備 取本品內(nèi)容物，研細，精密稱取0.214 6 g(含鹽酸小檗堿和甲氧芐啶100和50 mg)，置于250 mL量瓶中，用體積分數(shù)為1%的鹽酸和50%的甲醇溶液溶解，稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液10 mL，置于100 mL量瓶中，用體積分數(shù)為1%的鹽酸和50%的甲醇溶液稀釋至刻度，即得。

2.3色譜條件及系統(tǒng)適用性實驗 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-0.05 mol·L-1磷酸二氫鉀(30∶70)為流動相；進樣量為20 μL；柱溫為30 ℃；流速為1.0 mL·min-1；檢測波長為270 nm。色譜圖見圖1。在該色譜條件下，理論塔板數(shù)分別按照鹽酸小檗堿和甲氧芐啶峰計算均不低于5 000，分離度符合要求。

圖1HPLC圖

A.對照品溶液；B.供試品溶液；C.陰性輔料溶液；1.甲氧芐啶；2.鹽酸小檗堿。

Fig.1 HPLC chromatograms

A.reference solution;B.sample solution;C.negative excipients solution；1.trimethoprim；2.berberine hydrochloride.

2.4方法學考察

2.4.1線性范圍 精密量取2.1項下制備的對照品儲備液5.0，10.0，15.0，20.0和25.0 mL，分別置于100 mL量瓶中，用體積分數(shù)為1%的鹽酸和50%的甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，制得系列對照品溶液。按照2.3項下色譜條件進行測定，以峰面積為縱坐標(y)、質(zhì)量濃度為橫坐標(x)，繪制標準工作曲線，經(jīng)回歸分析，鹽酸小檗堿質(zhì)量濃度在10.026 9～50.134 3 μg·mL-1范圍內(nèi)有良好的線性關系，回歸方程為：y1=9.324×104x1-1.051×104，r1=0.999 9；甲氧芐啶在5.174 6～25.873 2 μg·mL-1范圍內(nèi)有良好的線性關系，回歸方程為:y2=2.467×104x2+3.960×103，r2=0.999 5。

2.4.2精密度實驗 精密吸取同一對照品溶液20 μL，連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖，鹽酸小檗堿和甲氧芐啶峰面積的RSD值分別為0.4%和0.6%(n=6)。

2.4.3穩(wěn)定性實驗 取10粒小檗堿甲氧芐啶膠囊內(nèi)容物，研細，精密稱取細粉，按照2.2項下方法進行制備，分別于0，2，4，8，12，16和24 h進行測定，記錄色譜圖，鹽酸小檗堿和甲氧芐啶峰面積的RSD值分別為0.7%和0.5%(n=7)。

2.4.4重復性實驗 精密稱取同一批小檗堿甲氧芐啶膠囊內(nèi)容物細粉6份，按照2.2項下方法進行制備，按照2.3項下色譜條件進行測定，記錄色譜圖，按照外標法計算，結(jié)果鹽酸小檗堿和甲氧芐啶的含量分別為標示量的96.8%和100.2%，RSD值分別為0.2%和0.5%(n=6)。

2.4.5加樣回收率實驗 精密稱取已知含量(鹽酸小檗堿96.3%，甲氧芐啶100.1%)的小檗堿甲氧芐啶膠囊(批號161203)細粉(含鹽酸小檗堿100 mg，甲氧芐啶50 mg)6份，置于250 mL量瓶中，加體積分數(shù)為1%的鹽酸和50%的甲醇溶液適量，使溶解并定量稀釋至刻度，搖勻，濾過；精密量取續(xù)濾液2.5 mL，置于50 mL量瓶中，加入含鹽酸小檗堿和甲氧芐啶質(zhì)量濃度分別為200.54 和103.49 μg·mL-1的混合對照品溶液4.0，5.0和6.0 mL，各2份，加體積分數(shù)為1%的鹽酸和50%的甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，即得加樣回收樣品溶液。按照2.3項下色譜條件進行測定，鹽酸小檗堿的平均回收率為99.9%，RSD值為0.3%(n=6)，甲氧芐啶的平均回收率為99.5%，RSD值為0.8%(n=6)，見表1。

表1鹽酸小檗堿和甲氧芐啶回收率測定結(jié)果

Tab.1 Determination results of recovery rate of berberine hydrochloride and trimethoprim

(n=6)

2.5含量測定 取2個廠家生產(chǎn)的小檗堿甲氧芐啶膠囊，每個廠家取3個批號，共計6個批次的藥品，按照2.2項下方法配制供試品溶液，按照2.3項下色譜條件進行測定，以外標法計算含量，結(jié)果見表2。

表2樣品測定結(jié)果

Tab.2 Determination results of samples (n=3)

3 討論

3.1方法的選擇 小檗堿甲氧芐啶膠囊是由鹽酸小檗堿和甲氧芐啶組成的復方制劑，臨床藥效強于二者單獨使用，現(xiàn)行制劑的質(zhì)量標準對2個組分分別進行質(zhì)量控制，對甲氧芐啶采用紫外分光光度法進行含量控制，該步驟繁瑣、操作不便，樣品消耗量大，同時大量使用氯仿等對人體毒害較大的有機試劑。為了簡化質(zhì)量標準，避免氯仿等有毒試劑的大量使用，本文利用HPLC法建立同時測定小檗堿甲氧芐啶膠囊中鹽酸小檗堿和甲氧芐啶含量的方法。

3.2溶劑的選擇 實驗中的溶劑同時考察了水，0.1 mol·L-1鹽酸，體積分數(shù)為1%的鹽酸甲醇溶液和體積分數(shù)為1%的鹽酸和50%的甲醇溶液。其中水，0.1 mol·L-1鹽酸和體積分數(shù)為1%的鹽酸甲醇溶液均出現(xiàn)了樣品中至少1種組分溶解不完全，而以體積分數(shù)1%的鹽酸和50%的甲醇溶液為溶劑時，樣品中2種組分完全溶解，同時液相系統(tǒng)中的溶劑峰對待測組分峰無干擾。

3.3測定波長的選擇 根據(jù)鹽酸小檗堿和甲氧芐啶的紫外吸收圖譜，鹽酸小檗堿在263 nm波長處有最大吸收，甲氧芐啶在270 nm波長處有最大吸收，綜合考慮鹽酸小檗堿和甲氧芐啶的紫外吸收特性，確定檢測波長為270 nm。

3.4流動相的選擇 參考相關研究[8-16]，流動相系統(tǒng)同時考察了乙腈-水，甲醇-水，乙腈-磷酸鹽緩沖液和甲醇-磷酸鹽緩沖液系統(tǒng)，結(jié)果乙腈-0.05 mol·L-1磷酸二氫鉀(30∶70)流動相系統(tǒng)可使鹽酸小檗堿和甲氧芐啶達到完全分離，且峰形良好，流動相對待測組分的分離沒有干擾。同時也考察了不同品牌的色譜柱，分離重復性良好。

本文首次建立HPLC法同時測定小檗堿甲氧芐啶膠囊中鹽酸小檗堿和甲氧芐啶含量的方法，該方法操作簡便、快速、準確、重復性好、取樣量小，可用于小檗堿甲氧芐啶膠囊中鹽酸小檗堿和甲氧芐啶2種組分的質(zhì)量控制，為小檗堿甲氧芐啶膠囊的質(zhì)量標準提供參考依據(jù)。