黃其春 ，鄭新添，黃翠琴，陳 彤，李虹儀

（1. 龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，福建龍巖 364012；2. 福建省家畜傳染病防治與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建龍巖364012；3. 福建省生豬疫病防控工程技術(shù)研究中心，福建龍巖 364012）

我國(guó)已把銀杏葉作為可飼用天然植物列入飼料原料目錄。目前，有關(guān)銀杏葉應(yīng)用于畜禽生產(chǎn)的研究報(bào)道大多涉及銀杏葉提取物（EGB）。EGB具有促進(jìn)斷奶仔豬和肉雞生長(zhǎng)、改善小腸形態(tài)等作用[1-3]。然而EGB提取制備工藝復(fù)雜且成本較高[4]，提取過程可能會(huì)造成大量生物活性物質(zhì)浪費(fèi)，其推廣應(yīng)用受到限制。中藥超微粉碎技術(shù)是近年來(lái)迅速發(fā)展的一門中藥加工技術(shù)。細(xì)胞壁是植物特有的結(jié)構(gòu)，中藥的有效成分主要分布在細(xì)胞內(nèi)。中藥經(jīng)超微粉碎后，90%以上的細(xì)胞可以破壁，細(xì)胞內(nèi)有效成分充分暴露出來(lái)，有效成分的溶出率和生物利用度明顯提高，從而節(jié)省原料、降低成本[5]。此外，與中藥提取物相比，中藥經(jīng)超微粉碎后仍然保持了中藥的全成分入藥[5]。目前，有關(guān)銀杏葉超微粉在畜禽生產(chǎn)中的試驗(yàn)研究鮮有報(bào)道。為此，本試驗(yàn)旨在探討銀杏葉超微粉對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能、腸道菌群、腸道形態(tài)和功能的影響，以期為銀杏葉的進(jìn)一步開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 銀杏葉購(gòu)自陜西中鑫生物技術(shù)有限公司。銀杏葉細(xì)粉和超微粉的制備分別采用低溫微粉碎設(shè)備、低溫超微粉碎設(shè)備，制備過程在江西省千目高科有限公司進(jìn)行。銀杏葉細(xì)粉D（0.50）和D（0.90）分別為63.7 μm和225.6 μm，銀杏葉超微粉D（0.50）和D（0.90）分別為 9.7 μm 和 18.8 μm。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)和日糧 按照公母各半、體重接近的原則，將120頭25日齡斷奶、體重為（6.88±0.34）kg的杜×長(zhǎng)×大三元雜交仔豬隨機(jī)分為3組，對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)日糧，試驗(yàn)組在基礎(chǔ)日糧中分別添加1.0%銀杏葉細(xì)粉和1.0%銀杏葉超微粉。每組設(shè)4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10頭。試驗(yàn)在原福建省龍巖市龍馬原種豬場(chǎng)進(jìn)行，預(yù)試期10 d，正試期28 d，其他按豬場(chǎng)飼養(yǎng)管理和免疫程序進(jìn)行。試驗(yàn)基礎(chǔ)日糧參照NRC（2012）仔豬營(yíng)養(yǎng)需要配制成粉料，由原福建省龍巖市龍馬原種豬場(chǎng)自行配制，其組成及營(yíng)養(yǎng)成分見表1。

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)成分（飼喂基礎(chǔ)）

1.3 樣品采集與處理 試驗(yàn)期間，每天記錄仔豬的采食量。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，從每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選取1頭體重相近的仔豬，采集血樣后屠宰，無(wú)菌采集直腸內(nèi)容物進(jìn)行菌群測(cè)定，采集腸道組織樣品用于形態(tài)學(xué)觀察。血樣采用肝素抗凝，3 000 r/min 離心10 min制備血漿，置于-70保存。十二指腸、空腸和回腸組織樣品分別采自各腸道中段，大小為1 cm×1 cm。各腸道樣品先用生理鹽水沖洗干凈，然后再置于10%甲醛溶液中固定，用于制作組織切片。

1.4 指標(biāo)測(cè)定

1.4.1 生長(zhǎng)性能 分別于試驗(yàn)正式開始和結(jié)束時(shí)，仔豬空腹稱重，以重復(fù)為單位統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)期間的耗料量，計(jì)算平均日增重、平均日采食量和耗料增重比。

1.4.2 腸道菌群 在超凈操作臺(tái)上，用無(wú)菌生理鹽水對(duì)直腸內(nèi)容物進(jìn)行10倍的配比稀釋，選擇合適的稀釋液，接種于相應(yīng)的培養(yǎng)基上，37 培養(yǎng)一定時(shí)間后，對(duì)大腸桿菌、沙門氏菌、乳酸桿菌和雙歧桿菌進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。其中大腸桿菌和沙門氏菌分別選擇10-4～10-6和10-3～10-5稀釋液，培養(yǎng)24 h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，所采用的培養(yǎng)基則分別為伊紅美蘭瓊脂培養(yǎng)基和SS瓊脂培養(yǎng)基；乳酸桿菌和雙歧桿菌選擇10-5～10-7稀釋液，在厭氧培養(yǎng)48 h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，所采用的培養(yǎng)基分別為L(zhǎng)BS培養(yǎng)基和BBL培養(yǎng)基。每個(gè)稀釋液做3個(gè)重復(fù)。菌落計(jì)數(shù)結(jié)果用每克腸道內(nèi)容物中細(xì)菌個(gè)數(shù)的對(duì)數(shù)（lg CFU/g）表示。

1.4.3 小腸形態(tài) 制作十二指腸、空腸和回腸石蠟切片，H.E.染色，光鏡下應(yīng)用LeicaQwin圖象分析軟件測(cè)量各腸道絨毛高度、隱窩深度，并計(jì)算其絨毛高度/隱窩深度。每個(gè)樣品測(cè)定10根最長(zhǎng)絨毛高度和相應(yīng)的隱窩深度，其平均值作為1個(gè)測(cè)定數(shù)據(jù)。

1.4.4 血漿D-乳酸、內(nèi)毒素含量和二胺氧化酶活性 分別采用分光光度法[6]、鱟試劑基質(zhì)偶氮顯色定量法、分光光度法[7]測(cè)定血漿D-乳酸含量、內(nèi)毒素含量和二胺氧化酶活性。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行方差分析和Duncan's多重比較，以P＜0.05為顯著水平。結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié) 果

2.1 銀杏葉超微粉對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能的影響 由表2可知，與對(duì)照組和1%銀杏葉細(xì)粉組相比，1%銀杏葉超微粉組斷奶仔豬平均日增重顯著提高（P＜0.05），耗料增重比顯著降低（P＜0.05）。1%銀杏葉細(xì)粉組斷奶仔豬生長(zhǎng)性能各指標(biāo)與對(duì)照組差異不顯著（P＞0.05）。

表2 銀杏葉超微粉對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能的影響

2.2 銀杏葉超微粉對(duì)斷奶仔豬直腸菌群的影響 由表3可知，與對(duì)照組和1%銀杏葉細(xì)粉組相比，1%銀杏葉超微粉組斷奶仔豬直腸大腸桿菌和沙門氏菌數(shù)量顯著降低（P＜0.05），乳酸桿菌和雙歧桿菌數(shù)量顯著增加（P＜0.05）。1%銀杏葉細(xì)粉組斷奶仔豬直腸大腸桿菌、沙門氏菌、乳酸桿菌和雙歧桿菌數(shù)量與對(duì)照組差異不顯著（P＞0.05）。

表3 銀杏葉超微粉對(duì)斷奶仔豬直腸菌群的影響 lg CFU/g

2.3 銀杏葉超微粉對(duì)斷奶仔豬小腸形態(tài)的影響 由表4可知，與對(duì)照組和1%銀杏葉細(xì)粉組相比，1%銀杏葉超微粉組斷奶仔豬十二指腸、空腸和回腸的絨毛高度、絨毛高度/隱窩深度顯著提高（P＜0.05），而且1%銀杏葉超微粉組斷奶仔豬十二指腸、空腸的隱窩深度還顯著降低（P＜0.05）。1%銀杏葉細(xì)粉組斷奶仔豬小腸形態(tài)各指標(biāo)與對(duì)照組差異不顯著（P＞0.05）。

表4 銀杏葉超微粉對(duì)斷奶仔豬小腸形態(tài)的影響

2.4 銀杏葉超微粉對(duì)斷奶仔豬血漿D-乳酸、內(nèi)毒素和二胺氧化酶的影響 由表5可知，與對(duì)照組和1%銀杏葉細(xì)粉組相比，1%銀杏葉超微粉組斷奶仔豬血漿D-乳酸水平、內(nèi)毒素含量、二胺氧化酶活性顯著降低（P＜0.05）。1%銀杏葉細(xì)粉組斷奶仔豬血漿D-乳酸水平、內(nèi)毒素含量、二胺氧化酶活性與對(duì)照組差異不顯著（P＞0.05）。

3 討 論

近年來(lái)，有關(guān)銀杏葉在生豬生產(chǎn)上應(yīng)用的試驗(yàn)研究主要涉及EGB。研究表明，日糧中添加適量EGB能提高斷奶仔豬的生長(zhǎng)性能[1-2]。但張相倫等[8]報(bào)道，銀杏葉對(duì)生長(zhǎng)育肥豬采食量沒有顯著影響；與對(duì)照組和0.50%普通粉碎銀杏葉組相比，日糧中添加0.05%、0.25%和0.50%超微粉碎銀杏葉對(duì)生長(zhǎng)育肥豬生長(zhǎng)性能具有一定的改善作用。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組和1.0%銀杏葉細(xì)粉組相比，1%銀杏葉超微粉組斷奶仔豬平均日增重顯著提高，耗料增重比顯著降低，說(shuō)明日糧中添加適量銀杏葉超微粉可以促進(jìn)斷奶仔豬生長(zhǎng)。銀杏葉含有黃酮類化合物、萜類化合物、聚戊烯醇、多糖、氨基酸和微量元素等多種生理活性物質(zhì)和有效成分[9-10]。研究表明，超微粉碎可以提高銀杏葉的細(xì)胞破壁率[11]，提高銀杏葉中黃酮、萜內(nèi)酯等有效成分的釋放量和釋放速度[12-14]。銀杏葉超微粉的飼喂效果優(yōu)于銀杏葉細(xì)粉，這可能是由于超微粉碎有助于促進(jìn)銀杏葉的有效成分在動(dòng)物腸道中釋放，促進(jìn)動(dòng)物的吸收，使其能夠更好地發(fā)揮生物學(xué)功能，具體機(jī)理還有待于進(jìn)一步研究。另外，在本試驗(yàn)分組過程中，盡管各組試驗(yàn)豬初始體重差異不顯著，但為了讓各組試驗(yàn)豬初始條件盡可能一致，還有待于采用隨機(jī)化完全區(qū)組設(shè)計(jì)進(jìn)行深入研究。

動(dòng)物腸道微生物菌群是否平衡直接影響著動(dòng)物腸道正常生理功能，進(jìn)而影響動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育。李焰等[3]報(bào)道，EGB可抑制肉雞腸道大腸桿菌的生長(zhǎng)繁殖，促進(jìn)乳酸桿菌增殖，從而改善肉雞腸道菌群結(jié)構(gòu)，在一定程度上促進(jìn)肉雞生長(zhǎng)。體外試驗(yàn)表明，銀杏葉超微粉經(jīng)浸提后，對(duì)大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等畜禽常見致病菌表現(xiàn)出一定的抑菌作用[11]。本試驗(yàn)表明，與對(duì)照組和1%銀杏葉細(xì)粉組相比，日糧中添加1.0%銀杏葉超微粉可以降低仔豬腸道大腸桿菌和沙門氏菌等有害菌的數(shù)量，提高乳酸桿菌、雙歧桿菌等有益菌數(shù)量，從而有效調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，使消化吸收功能更加完善，最終提高動(dòng)物生長(zhǎng)性能，這與本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的1.0%銀杏葉超微粉可顯著提高斷奶仔豬生長(zhǎng)性的結(jié)果一致。銀杏葉超微粉的作用效果要好于銀杏葉細(xì)粉，其原因可能是超微粉碎使銀杏葉的有效成分更容易溶出，在動(dòng)物腸道中能較好地發(fā)揮出生物學(xué)功能，具體機(jī)理仍需進(jìn)一步研究。

在斷奶應(yīng)激狀態(tài)下，仔豬小腸形態(tài)受損，絨毛變短，隱窩變深，由此影響腸道對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，使仔豬生長(zhǎng)受阻。研究表明，EGB能改善斷奶仔豬和肉雞的小腸形態(tài)，提高營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化利用率，促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)[2-3]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組和1%銀杏葉細(xì)粉組相比，1%銀杏葉超微粉組斷奶仔豬十二指腸、空腸和回腸的絨毛高度、絨毛高度/隱窩深度顯著提高，十二指腸、空腸的隱窩深度顯著降低，這說(shuō)明日糧中添加1.0%銀杏葉超微粉也能夠改善斷奶仔豬的小腸形態(tài)，進(jìn)而增強(qiáng)仔豬腸道消化和吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的功能，使仔豬生長(zhǎng)發(fā)育加快，這與本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的1.0%銀杏葉超微粉組斷奶仔豬平均日增重顯著提高、耗料增重比顯著降低的結(jié)果一致。

除具有消化吸收功能外，腸道還具有重要的屏障功能。斷奶應(yīng)激會(huì)引起仔豬腸道屏障功能受損，導(dǎo)致腸道通透性增高，腸道中D-乳酸、內(nèi)毒素和腸上皮釋放的二胺氧化酶進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)，血漿D-乳酸水平、內(nèi)毒素含量和二胺氧化酶活性出現(xiàn)病理性升高[15-16]。測(cè)定血漿D-乳酸水平、內(nèi)毒素含量和二胺氧化酶活性可以及時(shí)反映腸道通透性變化和屏障功能狀態(tài)[17]。研究表明，日糧中添加0.2%EGB能降低斷奶仔豬腸道通透性，保護(hù)腸道屏障功能[3]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組和1.0%銀杏葉細(xì)粉組相比，日糧中添加1.0%銀杏葉超微粉可以緩解斷奶后仔豬腸道通透性增高，使斷奶仔豬血漿D-乳酸水平、內(nèi)毒素含量和二胺氧化酶活性降低，保護(hù)腸道屏障功能，維持腸道功能完整性。

綜上所述，日糧中添加1.0%銀杏葉超微粉可改善斷奶仔豬腸道菌群平衡和小腸形態(tài)，保護(hù)腸道屏障功能，從而提高斷奶仔豬生長(zhǎng)性能。