孔令聯(lián)，崔艷軍，楊金勇，李東平，劉東鑫， 王 羽中*， 茅慧玲*

（1. 浙江農(nóng)林大學(xué)動物科技學(xué)院，動物營養(yǎng)研究所，浙江杭州 311300；2. 浙江省畜牧技術(shù)推廣總站，浙江杭州 310021）

氧化應(yīng)激是機體內(nèi)氧化-抗氧化平衡狀態(tài)的一種失衡，會導(dǎo)致細(xì)胞損傷。大多數(shù)細(xì)胞能夠承受一定程度的氧化應(yīng)激，這是由于其具有足夠的抗氧化防御能力和修復(fù)系統(tǒng)，能夠識別和清除被氧化損傷的分子[1]。當(dāng)體內(nèi)高活性分子如活性氧（ROS）產(chǎn)生過多且超出機體的防御能力時，就會導(dǎo)致氧化應(yīng)激，從而導(dǎo)致諸如脂類、DNA和蛋白質(zhì)等生物大分子的損傷，并可導(dǎo)致疾病[2]。

小腸上皮細(xì)胞是體內(nèi)更新速度最快的一類細(xì)胞，消化食物、吸收營養(yǎng)的同時防止有害物質(zhì)侵入體內(nèi)，其結(jié)構(gòu)和功能的完整性對奶牛的健康狀況和生產(chǎn)性能有重要影響。引起奶牛氧化應(yīng)激的因素有很多，包括高強度代謝、環(huán)境因素、日糧結(jié)構(gòu)等[3]。腸上皮細(xì)胞容易受到氧化應(yīng)激的影響，在多種生理、病理及飲食不當(dāng)過程中都可能產(chǎn)生氧化損傷，如炎性腸病、斷奶應(yīng)激、熱應(yīng)激等[4]。目前，在細(xì)胞水平上關(guān)于奶牛氧化應(yīng)激的報道主要集中在乳腺，對奶牛腸細(xì)胞氧化損傷機制的研究甚少，因此建立奶牛小腸上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激模型，對于揭示細(xì)胞氧化應(yīng)激機制、研究開發(fā)抗氧化型日糧，提高機體抗氧化能力和腸道營養(yǎng)物質(zhì)吸收能力具有重要的意義。過氧化氫（H2O2）是一種氧化作用較強的ROS，可誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激，由于其性質(zhì)相對穩(wěn)定且易于獲得，被廣泛應(yīng)用于各類細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的研究[5]。本試驗利用奶牛小腸上皮細(xì)胞系，以H2O2為誘導(dǎo)劑，建立奶牛小腸上皮細(xì)胞體外氧化應(yīng)激模型，為進一步研究奶牛腸道的氧化損傷機制及氧化應(yīng)激下的營養(yǎng)物質(zhì)吸收規(guī)律提供平臺和基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 永生化奶牛小腸上皮細(xì)胞系（取自空腸段）購自上海賽齊生物工程有限公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司；PBS、0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液購自上海生工生物工程有限公司；噻唑藍(lán)（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）、氯化硝基四氮唑藍(lán)（NBT）、甲醇、氫氧化鉀均購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；3%H2O2、乳酸脫氫酶（LDH）、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；96孔板和6孔板購自Corning公司。CO2培養(yǎng)箱（THermo）、倒置顯微鏡（Motic）、酶標(biāo)儀（THermo）、T6紫外可見光分光光度計（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）。

1.2 試劑配制 H2O2貯備液的配制：3% H2O2濃度約為882 mmol/L，分別加入無菌雙蒸水稀釋至50、100、200、400、800 mmol/L作為貯備液備用。

處理培養(yǎng)液的配制：分別取20 μL不同濃度的H2O2貯備液加入到19.98 mL的DMEM培養(yǎng)基中[6]，使處理培養(yǎng)液中H2O2濃度分別為0、50、100、200、400、800 μmol/L。配制好的培養(yǎng)基過濾除菌，H2O2貯備液現(xiàn)用現(xiàn)配。

氯化硝基四氮唑藍(lán)（NBT）反應(yīng)液的配制：準(zhǔn)確稱取10 mg NBT，加無菌PBS溶解定容至10 mL，配制成濃度為1 mg/mL的NBT反應(yīng)液過濾除菌備用。

1.3 試驗方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)與試驗分組 將奶牛小腸上皮細(xì)胞按3×105個/mL接種在含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/mL鏈霉素、10 mmol/L Hepes緩沖液、2 mmol/LL-谷氨酰胺的DMEM培養(yǎng)基中，放入37 、5% CO2培養(yǎng)箱中溫育，每2～3 d傳代1次，取對數(shù)生長期的第3代貼壁生長的細(xì)胞用于試驗，對數(shù)期為2～4 d。試驗一：采用單因子完全隨機試驗設(shè)計，將細(xì)胞隨機分為6組，每組6個重復(fù)，試驗重復(fù)3次。試驗組培養(yǎng)液中分別添加0、50、100、200、400、800 μmol/L 的 H2O2（0 μmol/L 為 對照組），分別作用細(xì)胞2、4、6 h，測定細(xì)胞存活率，初步篩選適宜的H2O2作用時間。試驗二：在篩選出適宜H2O2作用時間（2 h）的基礎(chǔ)上，采用單因子完全隨機試驗設(shè)計，用不同濃度（0、50、100、200、400、800 μmol/L）的H2O2分別作用細(xì)胞2 h，收集細(xì)胞和培養(yǎng)液，測定抗氧化指標(biāo)，進一步篩選出建立奶牛小腸上皮細(xì)胞氧化損傷模型的適宜H2O2濃度。

1.3.2 細(xì)胞存活率檢測 采用MTT比色法檢測細(xì)胞存活率[7]，取對數(shù)生長期奶牛腸小上皮細(xì)胞以5×104個/mL細(xì)胞密度接種于96孔板上，共設(shè)6組，每組6個重復(fù)孔，試驗重復(fù)3次，置于37 、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，去除培養(yǎng)液，每孔分別加入100 μL的0、50、100、200、400、800 μmol/L H2O2濃度的處理培養(yǎng)液，分別處理細(xì)胞2、4 、6 h，去除處理培養(yǎng)液，換新鮮培養(yǎng)液，同時每孔加入20 μL 5 g/L的MTT，于37 、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h，去除培養(yǎng)液及MTT，每孔加入150 μL 二甲基亞砜（DMSO），震蕩5 min，用酶標(biāo)儀測定各孔在波長490 nm處的吸光度。根據(jù)下列公式計算存活率。

1.3.3 ROS檢測 采用NBT還原法檢測ROS[8]。NBT法通常作為超氧化物的檢測方法，可生成難溶的藍(lán)色結(jié)晶甲瓚，同樣也可用于ROS檢測[9]。將對數(shù)生長期的奶牛小腸上皮細(xì)胞以5×104個/mL細(xì)胞密度制成細(xì)胞懸液，每孔100 μL接種于96孔板上，加入H2O2處理2 h，去除含H2O2的培養(yǎng)液，PBS洗3遍，加入NBT反應(yīng)液，每孔100 μL，37 、5% CO2孵育2 h，去除NBT反應(yīng)液，每孔加入200 μL甲醇，5 min后用70%甲醇洗2次，去除液體、吹干，每孔加入120 μL 2 mol/L的氫氧化鉀（KOH）和140 μL DMSO。待結(jié)晶物充分溶解后，用酶標(biāo)儀測定各孔在波長620 nm處的吸光度值。

1.3.4 LDH、SOD、GSH-Px測定 將奶牛小腸上皮細(xì)胞以2×105個/mL的密度接種于6孔板，試驗重復(fù)3次，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞長至70%～80%，換含H2O2的處理培養(yǎng)液，H2O2處理2 h后，收集細(xì)胞培養(yǎng)液于2 mL Eppendof管中，12 000 r/min離心10 min，取上清用于LDH活性測定。取細(xì)胞，無菌PBS洗2遍，加入0.25%胰蛋白酶-EDTA消化，收集細(xì)胞懸液于10 mL離心管，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入無菌PBS洗1次再離心5 min，棄上清后加入1 mL PBS制成細(xì)胞懸液，細(xì)胞破碎儀破碎（冰水浴，功率200 W，超聲3 s，間隔4 s，超聲5 min），參照南京建成生物工程研究所提供的試劑盒說明書，測定細(xì)胞內(nèi)SOD和GSH-Px活性。LDH活性采用微板法測定，單位定義為1 000 mL細(xì)胞培養(yǎng)液37 與基質(zhì)作用15 min，在反應(yīng)體系中產(chǎn)生1 μmol丙酮酸為1單位；SOD活性采用黃嘌呤氧化酶法測定，單位定義為每毫升反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)50%時所對應(yīng)的SOD量為一個SOD活力單位（U）；GSH-Px活性采用比色法測定，單位定義為每0.1 mL反應(yīng)液在37 反應(yīng)5 min，扣除非酶促反應(yīng)作用，使反應(yīng)體系中GSH濃度降低1 μmol/L為一個酶活力單位。

1.4 統(tǒng)計分析 試驗采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件，選擇單因素ANOVA程序?qū)?shù)據(jù)進行方差分析，兩兩比較采用LSD法。結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差 。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 H2O2對奶牛小腸上皮細(xì)胞存活率的影響 由表1可見，隨著H2O2濃度增加，H2O2處理組細(xì)胞存活率較對照組顯著降低（P＜0.05）。50 μmol/L組存活率均在80%以上，細(xì)胞損傷較小；100 μmol/L組處理細(xì)胞6 h后，細(xì)胞存活率 降低至55%，2 h和4 h組存活率均大于70%；200 μmol/L組處理細(xì)胞2 h后，細(xì)胞存活率相對于對照組顯著降低至64.03%（P＜0.05），符合建立氧化應(yīng)激模型的條件；400、800 μmol/L組存活率進一步降至30%左右，細(xì)胞存活率較低。

表1 H2O2對奶牛小腸上皮細(xì)胞存活率的影響（n=6） %

2.2 H2O2作用2 h對奶牛小腸上皮細(xì)胞形態(tài)的影響由圖1可見，不同濃度H2O2處理奶牛小腸上皮細(xì)胞2 h后，對照組細(xì)胞貼壁良好，形態(tài)正常且分布均勻；50、100 μmol/L組細(xì)胞形態(tài)無明顯變化，細(xì)胞間隙變大，少量細(xì)胞變圓脫落；200 μmol/L組細(xì)胞體積縮小，細(xì)胞間隙增大并出現(xiàn)小部分脫落，少量細(xì)胞變圓死亡；400、800 μmol/L組細(xì)胞形態(tài)顯著改變，細(xì)胞變圓變亮，死亡數(shù)量較多；800 μmol/L組大量細(xì)胞脫落，細(xì)胞核突出，產(chǎn)生了DNA損傷。

2.3 細(xì)胞內(nèi)ROS和培養(yǎng)液中LDH含量 由表2可見，隨著H2O2濃度的增加，100～800 μmol/L組細(xì)胞內(nèi)ROS含量相對于對照組和50 μmol/L組顯著上升（P＜0.05）。細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH含量隨著H2O2濃度的增加逐漸升高，當(dāng)濃度達(dá)到200 μmol/L時，LDH的含量顯著高于對照組（P＜0.05）。

圖1 H2O2作用2 h對奶牛小腸上皮細(xì)胞形態(tài)的影響（×100 ）

2.4 H2O2作用2 h對奶牛小腸上皮細(xì)胞ROS、LDH、SOD、GSH-Px活性的影響 由表2可見，50 μmol/L組細(xì)胞內(nèi)T-SOD活性較對照組無顯著變化（P＞0.05），100 μmol/L組T-SOD活性上升（P＞0.05）；相對于對照組，200、400、800 μmol/L組T-SOD活性顯著降低（P＜0.05）。隨著H2O2濃度增加，細(xì)胞內(nèi)GSH-Px活性呈降低趨勢，當(dāng)H2O2濃度達(dá)到200 μmol/L時，與對照組相比細(xì)胞內(nèi)GSH-Px活性顯著降低（P＜0.05）。

3 討 論

氧化應(yīng)激是ROS在體內(nèi)產(chǎn)生的一種負(fù)面作用，機體在受到外界刺激及生理代謝過程中會產(chǎn)生很多具有潛在毒性的自由基[10]，這些物質(zhì)具有高度的活性，可以修改蛋白質(zhì)、脂類和核酸（DNA和RNA）等多種生物大分子，導(dǎo)致細(xì)胞氧化應(yīng)激，引發(fā)功能障礙，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。高產(chǎn)奶牛代謝旺盛，腸道作為消化和吸收的主要部位容易發(fā)生氧化應(yīng)激并產(chǎn)生損傷。H2O2可穿過細(xì)胞膜與細(xì)胞內(nèi)Fe2+反應(yīng)生成高活性的自由基，且由于H2O2性質(zhì)相對穩(wěn)定且易于獲得，已經(jīng)成為研究細(xì)胞氧化損傷的重要工具[11]。不同細(xì)胞建立氧化應(yīng)激模型的條件存在顯著差異，這可能與細(xì)胞本身的耐受性有關(guān)，但選用的存活率大都在50%～70%。細(xì)胞存活率過高說明細(xì)胞氧化應(yīng)激不明顯；細(xì)胞存活率過低說明細(xì)胞產(chǎn)生了不可逆損傷，細(xì)胞大量死亡。ROS包括超氧陰離子（O2-）、羥自由基（?OH）和H2O2等，對細(xì)胞有很強的破壞性，即使ROS是正常呼吸過程中產(chǎn)生的，也會造成累積的損傷，最終導(dǎo)致細(xì)胞和組織功能喪失。本試驗選用200 μmol/L的H2O2作用奶牛小腸上皮細(xì)胞2 h，細(xì)胞存活率顯著降低至64.03%且ROS產(chǎn)量相對于對照組顯著上升，說明細(xì)胞產(chǎn)生了一定程度的氧化損傷，同時又保持了較理想的存活率，符合建立模型的條件。

表2 H2O2作用2 h對奶牛小腸上皮細(xì)胞ROS、LDH、SOD、GSH-Px活性的影響(n=3)

LDH存在于機體所有組織細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)，細(xì)胞發(fā)生氧化損傷時，細(xì)胞膜受損，胞質(zhì)內(nèi)的LDH外泄出來。LDH在細(xì)胞培養(yǎng)液中的含量變化反映了細(xì)胞膜的損傷程度。本試驗結(jié)果表明，隨著H2O2濃度提高，培養(yǎng)液中LDH含量顯著上升，說明細(xì)胞產(chǎn)生了不同程度的氧化損傷。正常狀態(tài)下，機體氧化與抗氧化系統(tǒng)處于平衡狀態(tài)，代謝過程中產(chǎn)生的ROS能被體內(nèi)的抗氧化酶及時清除，如SOD和GSH-Px。超氧化物主要通過SOD來調(diào)節(jié)[12]，作為氧化磷酸化的副產(chǎn)物，線粒體會產(chǎn)生大量O2-，SOD使其轉(zhuǎn)化為H2O2，再由GSH-Px將H2O2分解為H2O。SOD和GSH-Px活性是機體抗過氧化能力的重要指標(biāo)。本試驗中細(xì)胞內(nèi)總SOD活性隨著H2O2濃度的提高呈先略升高再顯著降低的趨勢，這可能是細(xì)胞內(nèi)氧化-抗氧化系統(tǒng)調(diào)控的結(jié)果，H2O2濃度為50、100 μmol/L時，細(xì)胞氧化損傷較輕，抗氧化系統(tǒng)通過提高SOD活性來緩解氧化應(yīng)激損傷；H2O2濃度為200 μmol/L時，SOD活性較對照組顯著降低，細(xì)胞發(fā)生了一定程度的氧化應(yīng)激。GSH-Px是抗氧化防御系統(tǒng)的重要組成部分[13]，是機體內(nèi)廣泛存在的一種重要的過氧化物分解酶，其活性中心為硒半胱氨酸。硒是GSH-Px酶系的組成成分，它能催化GSH變?yōu)镚SSG，使有毒的過氧化物還原成無毒的羥基化合物，同時促進H2O2分解，從而保護細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)及功能不受損害。本試驗中，H2O2作用細(xì)胞2 h后GSH-Px活性逐漸降低，當(dāng)H2O2濃度達(dá)到200 μmol/L時，GSH-Px活性相對于對照組顯著降低，導(dǎo)致細(xì)胞抗氧化防御能力下降，干擾了氧化和抗氧化系統(tǒng)之間的平衡，產(chǎn)生氧化損傷。

4 結(jié) 論

本試驗中，200 μmol/L H2O2作用奶牛小腸上皮細(xì)胞2 h，可成功構(gòu)建以H2O2為誘導(dǎo)劑的奶牛小腸上皮細(xì)胞氧化損傷模型，為今后研究氧化應(yīng)激下奶牛腸道養(yǎng)分消化吸收提供平臺和基礎(chǔ)。