張 晗，馬銘鈞，黃富碩，王 皓，鄭 鵬，張貴學(xué)

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030）

防御素（Defensin）是一類不含糖鏈的堿性陽離子多肽，是機(jī)體天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分。防御素具有十分廣泛的抗菌譜，除了抗菌和抗病毒作用外，還發(fā)揮出許多免疫作用[1-2]。生殖道先天免疫隨發(fā)情周期變化而變化[3]，動物發(fā)情周期中卵巢主要產(chǎn)生雌二醇（Estradiol，E2）和孕酮（Progesterone，P4），E2是卵泡期卵泡分泌的一種類固醇激素，P4是黃體期黃體分泌的一種類固醇激素，二者在發(fā)情周期中呈周期性變化[4]。卵泡期E2濃度升高，子宮頸舒張，生殖道和外界空氣接觸，這時環(huán)境中的微生物侵入的可能性很大，引起生殖道免疫反應(yīng)；而黃體期P4濃度升高，子宮頸收縮[5]，空氣環(huán)境中微生物對生殖道的刺激相對較小，免疫反應(yīng)相對較弱。已有研究表明，雌激素和孕激素除了調(diào)節(jié)發(fā)情周期外，還參與生殖道先天免疫，并對防御素有調(diào)節(jié)作用[6]。

Hela細(xì)胞系是源自一位美國黑人婦女Henrietta Lacks（縮寫Hela）的宮頸癌細(xì)胞的細(xì)胞系。本實驗旨在通過E2和P4處理Hela細(xì)胞，模擬體內(nèi)發(fā)情周期（卵泡期和黃體期）的變化，檢測防御素表達(dá)是否與發(fā)情周期變化有關(guān)，為提高繁殖效率提供理論和實踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞處理 實驗采用89% DEMEM 高糖培養(yǎng)基（Gibco）+ 10%胎牛血清（ScienCell）+1%雙抗（碧云天）的培養(yǎng)液培養(yǎng)Hela細(xì)胞（Hela細(xì)胞株ATCC，編號CCL-2），待細(xì)胞匯合至80%～90%時，不同濃度17-β雌二醇E2（0、0.1、5、10 ng/mL）和孕烯二酮P4（0、20、40、60 ng/mL）（Sigma）處理Hela細(xì)胞，48 h后收集細(xì)胞供熒光定量PCR及Western Blot檢測。

1.2 引物設(shè)計 根據(jù)GenBank中人β-actin 基因（登錄號為X00351.1）、防御素α1（DEFA1）和防御素β1（DEFB1）（登錄號為NM_004084.3，NM_005218.3）用Primer 5.0 軟件分別設(shè)計特異性引物。引物由吉林庫美生物科技有限公司合成（表1）。

1.3 總RNA提取 Trizol（Ambion）法提取樣品總RNA，用DEPC水溶解RNA沉淀后放置于-80 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 cDNA 合成 采用試劑盒（abm 5×All-Ⅰn-OneMasterMix，Abm）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA放置于-20 保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 引物序列

1.5 q-PCR 以 2-ΔΔCt方法進(jìn)行 q-PCR 以計算目的基因相對表達(dá)水平，其中 ΔCt =Ct值目的基因－ Ct值內(nèi)參基因，ΔΔC =（Ct值試驗組目的基因－ Ct值試驗組內(nèi)參基因）－（Ct值對照組目的基因－ Ct值對照組內(nèi)參基因）。

具體操作：利用反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA，同時對目的基因（DEFA1和DEFB1）和內(nèi)參基因（β-actin）進(jìn)行熒光定量 PCR檢測，應(yīng)用abm EvaGreen 2×q-PCR MasterMix-ROX 試劑盒（Abm）和ABⅠ Prism 7500 sequence detection system。 反 應(yīng) 10 μL 體 系：Rox 5 μL、Primer F 0.3 μL、Primer R 0.3 μL、DNA template 1 μL、Nuclease-free H2O 3.4 μL。

1.6 統(tǒng)計分析 結(jié)果通過統(tǒng)計軟件SPSS 19.0進(jìn)行方差分析并以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差形式表示，以P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著，P＞0.05為差異不顯著。

1.7 Western-Blot 蛋白質(zhì)印跡法檢測內(nèi)參基因（β-actin）和抗體DEFA1和DEFB1（武漢三英生物公司）的表達(dá)，ECL化學(xué)發(fā)光法（碧云天）顯影成像。再利用Ⅰmage-Pro 6.0分析蛋白條帶灰度。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度E2對防御素DEFA1和DEFB1的影響

2.1.1 不同濃度E2對防御素DEFA1和DEFB1mRNA的影響 由表2表明，E2為10 ng/mL時，防御素DEFA1和DEFB1mRNA表達(dá)量顯著高于其他組，其中DEFB1達(dá)到差異極顯著水平（P＜0.01），且防御素DEFA1和DEFB1mRNA表達(dá)量均隨E2濃度升高呈上升趨勢。

表2 不同濃度E2對DEFA1和DEFB1 mRNA的影響

2.1.2 不同濃度E2對防御素DEFA1蛋白的影響 由圖1可見，防御素DEFA1蛋白表達(dá)量隨E2濃度升高而升高，0.1 ng/mL組DEFA1顯著高于0 ng/mL組（P＜0.05），5 ng/mL和10 ng/mL組極顯著高于0 ng/mL組（P＜0.01）。

圖1 不同濃度E2對DEFA1蛋白表達(dá)的影響

2.2 不同濃度P4對防御素DEFA1和DEFB1的影響

2.2.1 不同濃度P4對防御素DEFA1和DEFB1mRNA的影響 表3表明，隨著P4濃度逐漸升高，防御素DEFA1和DEFB1表達(dá)量逐漸下降。40、60 ng/mL P4組DEFA1表達(dá)量顯著低于0 ng/mL P4組（P＜0.05）；60 ng/mL P4組DEFB1的表達(dá)量極顯著低于0 ng/mL P4組（P＜0.01），顯著低于 20 ng/mL P4組（P＜0.05），而與40 ng/mL P4組相比差異不顯著。

表3 不同濃度P4對DEFA1和DEFB1 mRNA的影響

2.2.2 不同濃度P4對防御素DEFA1蛋白的影響 圖2表明，隨著P4濃度升高，防御素DEFA1蛋白表達(dá)量逐漸下降（P＜0.05），且 60 ng/mL P4組DEFA1蛋白極顯著低于 0、20、40 ng/mL P4組（P＜0.01）。

3 討 論

防御素作為一類大量存在于哺乳動物上皮組織內(nèi)的內(nèi)源性抗微生物肽，在有機(jī)體非特異性免疫反應(yīng)中占重要地位，國內(nèi)外研究者非常重視其在感染免疫中的作用，其研究成果有可能為防治一些重要的感染性疾病開辟新思路。

圖2 不同濃度P4對DEFA1蛋白表達(dá)的影響

本實驗中，不同濃度E2和P4影響防御素DEFA1和DEFB1表達(dá)。DEFA1和DEFB1表達(dá)量均隨E2濃度升高而上升，濃度為10 ng/mL時達(dá)到最大，即在卵泡期E2促進(jìn)了防御素表達(dá)；DEFA1和DEFB1的相對表達(dá)量隨著P4濃度升高逐漸下降，即在黃體期P4抑制了防御素表達(dá)。子宮頸位于生殖系統(tǒng)外端，通過外生殖道和空氣接觸，受外界環(huán)境影響較大。發(fā)情期血液中E2濃度升高，促進(jìn)子宮頸口開張[7]，受環(huán)境空氣影響增大，需要第一道防御屏障強(qiáng)化，以防御空氣微生物的繁衍，即在E2作用下，細(xì)胞增強(qiáng)防御素的產(chǎn)生。黃體期P4濃度升高，促進(jìn)子宮頸收縮[7]，與空氣接觸減少，空氣環(huán)境影響相對變小，第1道防御屏障弱化，在P4作用下，防御素的表達(dá)量下降。也有研究表明，E2能促進(jìn)綿羊生殖道防御素的表達(dá)，雌激素濃度變化和防御素的表達(dá)量呈正相關(guān)[5]。盡管唐博等[8]結(jié)果顯示一定濃度P4（10-9～10-6mol/L）對培養(yǎng)的輸卵管上皮細(xì)胞β-防御素的表達(dá)有促進(jìn)作用，這種差異可能和細(xì)胞所處部位及生理狀態(tài)有關(guān)，輸卵管細(xì)胞位于生殖系統(tǒng)腹腔端，不易或不受外界空氣刺激的影響，保證卵子成熟、受精和早期胚胎發(fā)育[9]。本實驗以子宮頸細(xì)胞系作為研究材料，與輸卵管細(xì)胞的差異需要進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

防御素的表達(dá)量變化與發(fā)情周期中E2和P4的變化規(guī)律密切相關(guān)。E2能促進(jìn)Hela細(xì)胞DEFA1和DEFB1的表達(dá)；P4能抑制Hela細(xì)胞DEFA1和DEFB1的表達(dá)。