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        孕酮和雌二醇對Hela細(xì)胞防御素DEFA1 和DEFB1 的影響

        2018-11-24 03:16:30馬銘鈞黃富碩張貴學(xué)
        中國畜牧雜志 2018年11期
        關(guān)鍵詞:影響

        張 晗,馬銘鈞,黃富碩,王 皓,鄭 鵬,張貴學(xué)

        (東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150030)

        防御素(Defensin)是一類不含糖鏈的堿性陽離子多肽,是機(jī)體天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分。防御素具有十分廣泛的抗菌譜,除了抗菌和抗病毒作用外,還發(fā)揮出許多免疫作用[1-2]。生殖道先天免疫隨發(fā)情周期變化而變化[3],動物發(fā)情周期中卵巢主要產(chǎn)生雌二醇(Estradiol,E2)和孕酮(Progesterone,P4),E2是卵泡期卵泡分泌的一種類固醇激素,P4是黃體期黃體分泌的一種類固醇激素,二者在發(fā)情周期中呈周期性變化[4]。卵泡期E2濃度升高,子宮頸舒張,生殖道和外界空氣接觸,這時環(huán)境中的微生物侵入的可能性很大,引起生殖道免疫反應(yīng);而黃體期P4濃度升高,子宮頸收縮[5],空氣環(huán)境中微生物對生殖道的刺激相對較小,免疫反應(yīng)相對較弱。已有研究表明,雌激素和孕激素除了調(diào)節(jié)發(fā)情周期外,還參與生殖道先天免疫,并對防御素有調(diào)節(jié)作用[6]。

        Hela細(xì)胞系是源自一位美國黑人婦女Henrietta Lacks(縮寫Hela)的宮頸癌細(xì)胞的細(xì)胞系。本實驗旨在通過E2和P4處理Hela細(xì)胞,模擬體內(nèi)發(fā)情周期(卵泡期和黃體期)的變化,檢測防御素表達(dá)是否與發(fā)情周期變化有關(guān),為提高繁殖效率提供理論和實踐依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 細(xì)胞處理 實驗采用89% DEMEM 高糖培養(yǎng)基(Gibco)+ 10%胎牛血清(ScienCell)+1%雙抗(碧云天)的培養(yǎng)液培養(yǎng)Hela細(xì)胞(Hela細(xì)胞株ATCC,編號CCL-2),待細(xì)胞匯合至80%~90%時,不同濃度17-β雌二醇E2(0、0.1、5、10 ng/mL)和孕烯二酮P4(0、20、40、60 ng/mL)(Sigma)處理Hela細(xì)胞,48 h后收集細(xì)胞供熒光定量PCR及Western Blot檢測。

        1.2 引物設(shè)計 根據(jù)GenBank中人β-actin 基因(登錄號為X00351.1)、防御素α1(DEFA1)和防御素β1(DEFB1)(登錄號為NM_004084.3,NM_005218.3)用Primer 5.0 軟件分別設(shè)計特異性引物。引物由吉林庫美生物科技有限公司合成(表1)。

        1.3 總RNA提取 Trizol(Ambion)法提取樣品總RNA,用DEPC水溶解RNA沉淀后放置于-80 保存?zhèn)溆谩?/p>

        1.4 cDNA 合成 采用試劑盒(abm 5×All-Ⅰn-OneMasterMix,Abm)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA放置于-20 保存?zhèn)溆谩?/p>

        表1 引物序列

        1.5 q-PCR 以 2-ΔΔCt方法進(jìn)行 q-PCR 以計算目的基因相對表達(dá)水平,其中 ΔCt =Ct值目的基因- Ct值內(nèi)參基因,ΔΔC =(Ct值試驗組目的基因- Ct值試驗組內(nèi)參基因)-(Ct值對照組目的基因- Ct值對照組內(nèi)參基因)。

        具體操作:利用反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA,同時對目的基因(DEFA1和DEFB1)和內(nèi)參基因(β-actin)進(jìn)行熒光定量 PCR檢測,應(yīng)用abm EvaGreen 2×q-PCR MasterMix-ROX 試劑盒(Abm)和ABⅠ Prism 7500 sequence detection system。 反 應(yīng) 10 μL 體 系:Rox 5 μL、Primer F 0.3 μL、Primer R 0.3 μL、DNA template 1 μL、Nuclease-free H2O 3.4 μL。

        1.6 統(tǒng)計分析 結(jié)果通過統(tǒng)計軟件SPSS 19.0進(jìn)行方差分析并以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差形式表示,以P<0.05為差異顯著,P<0.01為差異極顯著,P>0.05為差異不顯著。

        1.7 Western-Blot 蛋白質(zhì)印跡法檢測內(nèi)參基因(β-actin)和抗體DEFA1和DEFB1(武漢三英生物公司)的表達(dá),ECL化學(xué)發(fā)光法(碧云天)顯影成像。再利用Ⅰmage-Pro 6.0分析蛋白條帶灰度。

        2 結(jié) 果

        2.1 不同濃度E2對防御素DEFA1和DEFB1的影響

        2.1.1 不同濃度E2對防御素DEFA1和DEFB1mRNA的影響 由表2表明,E2為10 ng/mL時,防御素DEFA1和DEFB1mRNA表達(dá)量顯著高于其他組,其中DEFB1達(dá)到差異極顯著水平(P<0.01),且防御素DEFA1和DEFB1mRNA表達(dá)量均隨E2濃度升高呈上升趨勢。

        表2 不同濃度E2對DEFA1和DEFB1 mRNA的影響

        2.1.2 不同濃度E2對防御素DEFA1蛋白的影響 由圖1可見,防御素DEFA1蛋白表達(dá)量隨E2濃度升高而升高,0.1 ng/mL組DEFA1顯著高于0 ng/mL組(P<0.05),5 ng/mL和10 ng/mL組極顯著高于0 ng/mL組(P<0.01)。

        圖1 不同濃度E2對DEFA1蛋白表達(dá)的影響

        2.2 不同濃度P4對防御素DEFA1和DEFB1的影響

        2.2.1 不同濃度P4對防御素DEFA1和DEFB1mRNA的影響 表3表明,隨著P4濃度逐漸升高,防御素DEFA1和DEFB1表達(dá)量逐漸下降。40、60 ng/mL P4組DEFA1表達(dá)量顯著低于0 ng/mL P4組(P<0.05);60 ng/mL P4組DEFB1的表達(dá)量極顯著低于0 ng/mL P4組(P<0.01),顯著低于 20 ng/mL P4組(P<0.05),而與40 ng/mL P4組相比差異不顯著。

        表3 不同濃度P4對DEFA1和DEFB1 mRNA的影響

        2.2.2 不同濃度P4對防御素DEFA1蛋白的影響 圖2表明,隨著P4濃度升高,防御素DEFA1蛋白表達(dá)量逐漸下降(P<0.05),且 60 ng/mL P4組DEFA1蛋白極顯著低于 0、20、40 ng/mL P4組(P<0.01)。

        3 討 論

        防御素作為一類大量存在于哺乳動物上皮組織內(nèi)的內(nèi)源性抗微生物肽,在有機(jī)體非特異性免疫反應(yīng)中占重要地位,國內(nèi)外研究者非常重視其在感染免疫中的作用,其研究成果有可能為防治一些重要的感染性疾病開辟新思路。

        圖2 不同濃度P4對DEFA1蛋白表達(dá)的影響

        本實驗中,不同濃度E2和P4影響防御素DEFA1和DEFB1表達(dá)。DEFA1和DEFB1表達(dá)量均隨E2濃度升高而上升,濃度為10 ng/mL時達(dá)到最大,即在卵泡期E2促進(jìn)了防御素表達(dá);DEFA1和DEFB1的相對表達(dá)量隨著P4濃度升高逐漸下降,即在黃體期P4抑制了防御素表達(dá)。子宮頸位于生殖系統(tǒng)外端,通過外生殖道和空氣接觸,受外界環(huán)境影響較大。發(fā)情期血液中E2濃度升高,促進(jìn)子宮頸口開張[7],受環(huán)境空氣影響增大,需要第一道防御屏障強(qiáng)化,以防御空氣微生物的繁衍,即在E2作用下,細(xì)胞增強(qiáng)防御素的產(chǎn)生。黃體期P4濃度升高,促進(jìn)子宮頸收縮[7],與空氣接觸減少,空氣環(huán)境影響相對變小,第1道防御屏障弱化,在P4作用下,防御素的表達(dá)量下降。也有研究表明,E2能促進(jìn)綿羊生殖道防御素的表達(dá),雌激素濃度變化和防御素的表達(dá)量呈正相關(guān)[5]。盡管唐博等[8]結(jié)果顯示一定濃度P4(10-9~10-6mol/L)對培養(yǎng)的輸卵管上皮細(xì)胞β-防御素的表達(dá)有促進(jìn)作用,這種差異可能和細(xì)胞所處部位及生理狀態(tài)有關(guān),輸卵管細(xì)胞位于生殖系統(tǒng)腹腔端,不易或不受外界空氣刺激的影響,保證卵子成熟、受精和早期胚胎發(fā)育[9]。本實驗以子宮頸細(xì)胞系作為研究材料,與輸卵管細(xì)胞的差異需要進(jìn)一步研究。

        4 結(jié) 論

        防御素的表達(dá)量變化與發(fā)情周期中E2和P4的變化規(guī)律密切相關(guān)。E2能促進(jìn)Hela細(xì)胞DEFA1和DEFB1的表達(dá);P4能抑制Hela細(xì)胞DEFA1和DEFB1的表達(dá)。

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