邢天宇，崔婷婷，黃佳新，閆曉紅，李 輝，王 寧

（農(nóng)業(yè)部雞遺傳育種重點實驗室，黑龍江省普通高等學(xué)校動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030）

DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)的重要研究內(nèi)容之一，其參與基因轉(zhuǎn)錄抑制、基因組印跡、細胞分化和發(fā)育的調(diào)控等多種生物學(xué)過程[1]。DNA甲基化在脂肪組織的生長發(fā)育中具有重要作用[2]。DNA甲基化通過調(diào)控脂肪細胞分化相關(guān)基因的表達，進而調(diào)控脂肪的生長發(fā)育[3]。PPARγ是脂肪生成和脂肪組織發(fā)育的關(guān)鍵調(diào)控因子。對哺乳動物研究發(fā)現(xiàn)，DNA甲基化調(diào)控PPARγ基因的表達[4-5]。前期研究發(fā)現(xiàn)，在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)高、低脂系肉雞中，脂肪組織PPARγ基因啟動子DNA甲基化與PPARγ基因表達呈負相關(guān)[6]。了解脂肪組織 DNA 甲基化對探究脂肪生長發(fā)育的分子機制以及控制動物肥胖癥具有重要意義。

miR-17-92基因簇是一個高度保守的miRNA基因簇，可編碼7個不同的成熟miRNA[7]。哺乳動物研究表明，該基因簇參與調(diào)控細胞增殖、分化及凋亡等多種生物學(xué)過程[8]。研究發(fā)現(xiàn)，雞miR-17-92基因簇參與調(diào)控雞脂肪細胞的增殖和分化[8-10]。實驗室前期獲得了雞miR-17-92基因簇上游的gap 區(qū)序列，鑒定出了雞miR-17-92基因簇宿主基因（MⅠR17HG）的啟動子區(qū)[11]。目前，對于人、鼠及雞MⅠR17HG啟動子區(qū)是否存在DNA甲基化以及是否受到DNA甲基化的調(diào)控都還不清楚。本研究對東北農(nóng)業(yè)大學(xué)高、低脂雞脂肪組織MⅠR17HG啟動子的DNA甲基化進行分析，為揭示雞脂肪組織生長發(fā)育的分子機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 DNA Marker購自TransGen。Prime ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、限制性內(nèi)切酶KpnⅠ、SmaⅠ和 T4 DNA 連接酶購自 TaKaRa。質(zhì)粒小量制備試劑盒、DNA純化回收試劑盒購自Axygen。Dual-Luciferase?Report自美國 Promega。LipofectamineTM2000購自美國Ⅰnvitrogen。DMEM、Opti-MEM、0.25%Trypsin-EDTA購自美國Gibco。FBS購自美國BⅠ。BstUⅠ酶 及 CpG Methyltransferase（M.SssⅠ） 購 自NEB。甲基化酶缺失的大腸桿菌（dam-/dcm-）購自全式金公司（北京）；DF1細胞（雞胚成纖維細胞）為本實驗室保存。雞脂肪組織來自本實驗室培育的東北農(nóng)業(yè)大學(xué)19世代高、低脂雞，其中2周齡低脂雞5只，高脂雞10只；3周齡高、低脂雞各5只；7周齡高、低脂雞各15只的腹部脂肪組織。雞MⅠR17HG啟動子報告基因載體pGL3-cMⅠR17HG（-4428/-2506）和A/T富集區(qū)啟動子報告基因載體（PGL3-AT-MⅠR17-92(-440/-1）為本實驗室保存的載體。

1.2 主要分子生物學(xué)軟件 Primer Premier 5.0；GraphPad Prism 5；NCBⅠ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）；UCSC（http://genome. ucsc.edu/）；JASPAR（http://jaspar.binf.ku.dk/）；EMBOSS（http://www.ebi.ac.uk/Tools/seqstats/emboss_cpgplot/）。

1.3 實驗方法

1.3.1 CpG島預(yù)測分析 從NCBⅠ數(shù)據(jù)庫獲得MⅠR17HG啟動子區(qū)序列，利用CpG島在線預(yù)測軟件（http://www.ebi.ac.uk/Tools/seqstats/emboss_cpgplot/）預(yù)測雞MⅠR17HG啟動子區(qū)3 300 bp（轉(zhuǎn)錄起始位點上游3 000 bp和轉(zhuǎn)錄起始位點下游300 bp）CpG島的位置及數(shù)量，參數(shù)設(shè)置為Observed/Expected radio＞ 0.60，Percent C+Percent G＞50.00，Length＞200。

1.3.2 Sequenom MassARRAY甲基化檢測 利用sequenom?EpiDesigner程序?qū)υ撔蛄羞M行引物設(shè)計，上游引物序列：5'-AGGAAGAGAGGTAGTTTATGGTGGTTG TAGGAAG-3'；下游引物序列：5'-CAGTAATACGACT CACTATAGGGAGAAGGCTCCCTCATTAAAATAAAA AACAAAATAC-3'。擴增DNA片段長度為399 bp，覆蓋64個CpG位點。采集東北農(nóng)業(yè)大學(xué)19世代高、低脂肉雞腹部脂肪組織20 mg，提取基因組DNA 2 μg。利用NaHSO3處理樣本，低速短暫離心后進行PCR 反應(yīng)，體系如下（8 μL）：ddH2O 4.90 μL，10×PCR Buffer 0.80 μL，dNTPs （200 μmol/L）0.80 μL，PCR Enzyme（5 U/μL）0.10 μL，上、下游引物各 0.20 μL（10 μmol/L），DNA 模板1 μL。 PCR 反應(yīng)條件：94 預(yù)變性 4 min，94 20 s，56 30 s，72 1 min，共45個循環(huán)，72延伸3 min。SAP反應(yīng)及T切反應(yīng)/RNase A 消化后，在Sequenom Mass ARRAY平臺上進行芯片點樣及數(shù)據(jù)輸出、分析等實驗工作。每個位點的甲基化程度表示檢測到的甲基化與未甲基化總和的百分比，從0～1表示，數(shù)值越大代表甲基化程度越高。

1.3.3 甲基化報告基因載體的構(gòu)建 為了確定DNA甲基化對MⅠR17HG啟動子活性的影響，將前期構(gòu)建的MⅠR17HG啟動子報告基因載體pGL3-cMⅠR17HG（-4428/-2506）轉(zhuǎn)化到甲基化酶缺失的大腸桿菌（dam-/dcm-）中，獲得未甲基化的miR-17-92基因簇啟動子報告基因載體。利用KpnⅠ和SmaⅠ對未甲基化的miR-17-92基因簇啟動子報告基因載體進行雙酶切，獲得未甲基化的miR-17-92基因簇啟動子片段，并利用CpG 甲基轉(zhuǎn)移酶 [CpG Methyltransferase（M.SssⅠ）]在 37 條件下處理未甲基化的miR-17-92基因簇啟動子片段，制備完全甲基化的miR-17-92基因簇啟動子片段。分別將未甲基化與完全甲基化的啟動子片段純化，并連接pGL3-basic，得到miR-17-92基因簇啟動子片段未甲基化或完全甲基化的報告基因載體。本研究選擇pGL3-ATMⅠR17-92（-440/-1）報告基因載體作為陰性對照，該載體所攜帶的啟動子為AT-MⅠR17-92（-440/-1），該啟動子無CpG位點，因此，其啟動子的活性不受DNA甲基化影響。M.SssⅠ甲基轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)體系為0.5 μg DNA，10×Buffer2 2 μL，10×SAM 2 μL，CpG 甲基轉(zhuǎn)移酶 1 μL，加水至20 μL。37 溫育，3 h，60 放置15 min使酶失活。采用限制性內(nèi)切酶BstUⅠ來檢測體外DNA甲基化是否成功。BstUⅠ可以酶切未甲基化啟動子片段，但不能切割完全甲基化的啟動子片段。經(jīng)BstUⅠ酶切鑒定證實啟動子片段被完全DNA甲基化后，用于后續(xù)報告基因活性分析。

1.3.4 細胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及報告基因活性檢測 采用含有10%胎牛血清和終濃度為100 U /mL青霉素、100 mg /L鏈霉素的DMEM/High glucose培養(yǎng)基培養(yǎng)DF1細胞，在37 含5% CO2和90%相對濕度的條件下培養(yǎng)。待細胞匯合度達到80%～90%，用0.25%胰蛋白酶/EDTA消化，將DF1細胞接種至24孔培養(yǎng)板，待細胞匯合度達到約70%時，采用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑，分別將MⅠR17HG啟動子的未甲基化和甲基化的報告基因載體pGL3-cMⅠR17HG（-4428/-2506）（0.4 μg）以及對照報告基因載體 pGL3-AT-MⅠR17-92（-440/-1）（0.4 μg）分別轉(zhuǎn)染DF1細胞，48 h后收集細胞裂解液，參照Dual-Luciferase Reporter Assay System（Promega） 說明書檢測報告基因活性。

1.4 統(tǒng)計分析 運用GraphPad Prism5 軟件處理數(shù)據(jù)，2組數(shù)據(jù)差異比較采用t檢驗方法，P＜0. 05（*） 為差異顯著，P＜0. 01（**）為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 雞MⅠR17HG啟動子區(qū)的CpG島分析 利用CpG島在線預(yù)測軟件（http://www.ebi.ac.uk/Tools/seqstats/emboss_cpgplot/）分析發(fā)現(xiàn)雞MⅠR17HG啟動子區(qū)存在1個CpG島，大小為710 bp，共有64個CpG位點。該CpG島位于轉(zhuǎn)錄起始位點上游457 bp至轉(zhuǎn)錄起始位點下游252 bp處（圖1）。CpG島的分析結(jié)果提示，雞MⅠR17HG啟動子可能會發(fā)生DNA甲基化。為確認雞MⅠR17HG啟動子是否存在甲基化，采用Sequenom MassARRAY技術(shù)檢測東北農(nóng)業(yè)大學(xué)高、低脂雞脂肪組織MⅠR17HG啟動子的甲基化情況。由于序列原因，只能檢測miR-17-92 基因簇上游3 056 ～3 500 bp區(qū)域的31個CpG位點的甲基化。

圖1 雞MⅠR17HG啟動子區(qū)的CpG島分析

2.2 雞MⅠR17HG啟動子的甲基化分析 2周齡低脂雞脂肪組織MⅠR17HG啟動子的總體甲基化水平顯著高于高脂雞（圖2-A），且CpG位點25、26、27、28的低脂甲基化程度顯著高于高脂（P＜0.05）（圖2-B）。3周齡高、低脂雞脂肪組織MⅠR17HG啟動子甲基化總體水平差異不顯著（P＞0.05）（圖3）。7周齡高、低脂雞脂肪組織MⅠR17HG啟動子的甲基化總體水平差異不顯著（P＞0.05）（圖4-A），但低脂雞MⅠR17HG啟動子的CpG位點41和CpG位點42的甲基化程度顯著低于高脂雞（P＜0.05）（圖4-B）。從整體看，2周齡低脂雞脂肪組織MⅠR17HG啟動子的甲基化總體水平極顯著高于3、7周齡低脂雞（P＜0.01）；2周齡高脂雞脂肪組織MⅠR17HG啟動子的總體甲基化水平也顯著高于7周齡高脂雞（P＜0.05）（圖5）。

圖2 2周齡高、低脂雞脂肪組織MⅠR17HG啟動子的甲基化比較分析

圖3 3周齡高、低脂雞脂肪組織MⅠR17HG啟動子的甲基化比較分析

圖4 7周齡高、低脂雞脂肪組織MⅠR17HG啟動子的甲基化比較分析

圖5 MⅠR17HG啟動子在高、低脂雞脂肪組織生長發(fā)育過程中DNA甲基化的比較分析

2.3 DNA甲基化對雞MⅠR17HG啟動子活性的影響為了確定DNA甲基化對MⅠR17HG啟動子活性的影響，將未甲基化與甲基化的MⅠR17HG啟動子片段（圖6-A）分別與報告基因載體pGL3-basic連接后，轉(zhuǎn)染細胞進行報告基因活性分析。AT-MⅠR17-92（-440/-1）為無CpG位點的啟動子對照。報告基因活性檢測顯示，與預(yù)期一致，甲基化和非甲基化處理對報告基因載體pGL3-AT-MⅠR17-92（-440/-1）的熒光素酶活性無顯著變化，但是甲基化的MⅠR17HG啟動子報告基因pGL3-cMⅠR17HG（-4428/-2506）活性極顯著低于未甲基化啟動子的報告基因活性（P＜0.01）（圖6-B）。這一結(jié)果提示DNA甲基化抑制MⅠR17HG啟動子活性。

圖6 DNA甲基化對MⅠR17HG啟動子活性的影響

3 討 論

miR-17-92基因簇在哺乳動物和雞脂肪生成中發(fā)揮重要作用[10,12]。大量研究發(fā)現(xiàn)，DNA甲基化能夠調(diào)控約50% miRNAs的表達，DNA甲基化的改變影響miRNA及其下游靶mRNAs的表達[3,13]。研究發(fā)現(xiàn)東北農(nóng)業(yè)大學(xué)高、低脂雞脂肪組織MⅠR17HG啟動子區(qū)存在DNA甲基化。東北農(nóng)業(yè)大學(xué)高、低脂雞的體重沒有明顯差異，但是脂肪性狀存在顯著差異，高脂雞的腹脂率是低脂雞5倍以上[14-15]。 本研究發(fā)現(xiàn)，2周齡高、低脂雞MⅠR17HG啟動子的甲基化總體水平明顯不同，且部分CpG位點的甲基化程度在高、低脂雞間存在較大差異；3、7周齡低脂雞MⅠR17HG啟動子的甲基化總體水平與高脂雞雖然沒有明顯的差異，但7周齡高、低脂雞脂肪組織MⅠR17HG啟動子也存在甲基化程度差異顯著的CpG位點，提示DNA甲基化可能調(diào)控MⅠR17HG基因的表達。

有研究表明，同一組織在不同生長發(fā)育階段其DNA的甲基化水平不同，大多數(shù)脊椎動物基因組DNA的甲基化隨著年齡增加而逐漸下降[16]。與此相一致，本研究發(fā)現(xiàn)高、低脂雞脂肪組織中MⅠR17HG啟動子的甲基化程度也隨著年齡增加而呈下降趨勢。

本研究中，DNA甲基化抑制MⅠR17HG啟動子的活性。目前已知啟動子區(qū)DNA甲基化可導(dǎo)致DNA構(gòu)象發(fā)生變化，從而影響轉(zhuǎn)錄因子與啟動子的結(jié)合從而抑制基因轉(zhuǎn)錄或?qū)е罗D(zhuǎn)錄效率下降[17]；另外，DNA甲基化結(jié)合蛋白（MBD/MeCP）可與啟動子區(qū)的甲基化DNA序列結(jié)合，從而使轉(zhuǎn)錄因子無法結(jié)合，導(dǎo)致基因表達抑制[2]。為了揭示高、低脂雞脂肪性狀的差異，未來將采用生物信息學(xué)方法分析高、低脂雞脂肪組織MⅠR17HG啟動子區(qū)差異甲基化的CpG位點，確定可能受到影響的轉(zhuǎn)錄因子，并采用EMSA和ChⅠP技術(shù)驗證DNA甲基化是否影響這些轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合進而導(dǎo)致基因表達的改變；還將采用ChⅠP技術(shù)比較分析高、低脂雞脂肪組織MⅠR17HG啟動子區(qū)DNA甲基化結(jié)合蛋白的結(jié)合情況。

4 結(jié) 論

雞脂肪組織MⅠR17HG啟動子區(qū)存在DNA甲基化，且高、低脂雞脂肪組織MⅠR17HG啟動子區(qū)的甲基化存在一定的差異。體外研究證實，DNA甲基化抑制MⅠR17HG啟動子活性。