潘建偉， 張晨燕， 周哉材

(1.浙江師范大學 化學與生命科學學院,浙江 金華 321004；2.蘭州大學 生命科學學院，甘肅 蘭州 730000)

1928年，荷蘭科學家Went[1]首次描述了生長素(auxin)及其在植物生長發(fā)育中的作用.隨后，美國科學家Thimann成功分離和鑒定出生長素主要成分吲哚-3-乙酸(indole-3-acetic acid,IAA).生長素幾乎參與調控植物每一個生長發(fā)育過程[2-3]，其對植物生長發(fā)育的調控作用主要取決于3個復雜的過程:生長素代謝、生長素運輸和生長素信號轉導.生長素的運輸分為2種途徑：被動運輸(不消耗能量，不固定運輸方向)與極性運輸(消耗能量，具有運輸方向).植物發(fā)育過程很大程度上是由生長素梯度(auxin gradient)分布引起，而這種梯度分布正是由生長素極性運輸所維持的[4].

生長素的極性運輸由3類轉運蛋白介導完成[5]，包括生長素輸入載體AUX1/LAX(auxin 1/like-auxin)[6-7]、生長素輸出載體PIN(pin-formed)[8-9]和ABCB/PGP(ATP-binding cassette B subfamily/P-glycoprotein)轉運體[10].其中，PIN蛋白的質膜極性分布模式在調節(jié)生長素不對稱分布方面起著重要作用，是決定生長素極性運輸方向的關鍵調控因子[11-12].擬南芥(Arabidopsisthaliana)基因組編碼8個PIN蛋白(PIN1—PIN8)均為跨膜蛋白.根據親水區(qū)的長短，將PIN蛋白分為2類：長PIN蛋白PIN1—PIN4及PIN7；短PIN蛋白PIN5，PIN6及PIN8[13].鑒于PIN蛋白的結構預測、功能驗證及表達模式已經有比較全面的綜述，本文在這些方面就不再贅述.PIN極性定位和輸出活性受多種機制調控：磷酸化/去磷酸化、極性錨定、胞內運輸等，本文著重介紹最近幾年有關PIN質膜極性定位和輸出活性的分子調控機理研究的最新進展.

1 PIN質膜極性定位與運輸活性的磷酸化調控機理

PIN蛋白的表達模式和亞細胞定位暗示轉錄翻譯后的修飾機制對PIN的生物學功能發(fā)揮重要作用[14].在PIN的修飾機制中，磷酸化機制一直被認為是調控PIN蛋白極性定位和運輸活性的重要機制之一.目前已知3類蛋白激酶家族涉及PIN蛋白磷酸化，包括AGC激酶(protein kinase A,G和C)、促分裂素原活化激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)和鈣調蛋白激酶(calmodulin-dependent protein kinase，CDPK)[9].植物通過去磷酸化機制拮抗PIN的磷酸化作用(見圖1)，表明PIN蛋白的磷酸化是一個可逆過程.

1.1 AGCVⅢ激酶調控PIN介導的生長素極性運輸

擬南芥基因組編碼39個AGC激酶，分為5個亞族：AGCVⅠ,AGCVⅡ,AGCVⅢ,PDK1及其他AGC基因[15].其中AGCVⅢ為最大的亞族，包含23個AGC激酶，細分為AGC1,AGC2,AGC3和AGC4 4類[16].

PIDs,D6PKs,CRK5和MKK7-MPK3/4等磷酸激酶使PIN蛋白磷酸化，調控其極性定位和活性；PP2A磷酸化酶拮抗磷酸化作用；MAB4和Pin1AT協同PID功能在不同側壁發(fā)揮功能.帶字母“P”的圓圈代表磷酸化.

圖1 磷酸化/去磷酸化調控PIN極性定位與活性[9，14]

PID(pinoid)蛋白和PID2,WAG1,WAG2同屬于AGCVⅢ激酶AGC3類[17]，統(tǒng)稱為PIDs，它們之間功能冗余，通過調控PIN的亞細胞定位來影響子葉的發(fā)育、頂勾的打開、根分生區(qū)的大小、果莢的形成等生物學過程[18-20].已有大量的實驗證據表明，非極性定位的PIDs通過直接磷酸化PIN親水區(qū)3個高度保守的絲氨酸位點(S1—S3)(見圖2)調控PIN從細胞基部定位到細胞頂部(見圖1)，從而影響生長素的分布[21-25].然而，磷酸化位點特異性抗體檢測表明，過表達PID后，質膜上、下兩端的PIN1 S1—S3位點均被磷酸化[26]，暗示PIN存在更復雜的PIDs磷酸化調控機理.

空心圓為PIDs和D6PKs激酶共同磷酸化位點，PIDs磷酸化偏向位點用實線圓標記，D6PKs磷酸化偏向位點用虛線圓標記；實心圓標記MKK7-MPK3/4級聯反應磷酸化位點；正方形標記AP-2連接蛋白分揀位點；三角形標記Pin1AT異構酶改變PIN構象的位點.

圖2 擬南芥PIN的功能位點示意圖[14]

D6PKs(D6 protein kinases)亞家族由D6PK,D6PKL1(D6PK-like 1),D6PKL2,D6PKL3組成，屬于AGCVⅢ的AGC1類蛋白激酶[27]，在下胚軸的向光性、背地性及側根和芽的分化過程中調控生長素的運輸[28-31].D6PKs在大部分細胞中極性分布，主要在根細胞中表達，與基部定位的PIN1,PIN2和PIN4相似[32].利用遺傳材料或藥劑處理使D6PKs功能缺失，都能降低PIN蛋白的磷酸化及生長素極性運輸速率，暗示D6PKs調控PIN介導的生長素極性輸出活性[25-26,29,32].D6PKs磷酸化PIN的位點除了S1—S3外，還包括另外2個絲氨酸位點S4和S5[25](見圖2).S4和S5在PIN3,PIN4及PIN7中保守，但在PIN1和 PIN2中發(fā)生突變.D6PKs過表達并不能導致PIN蛋白極性的改變[25]，它與PIDs磷酸化的不同功能被歸因于不同的磷酸化位點偏好[25,33](見圖2).而最新研究發(fā)現,根尖細胞基部定位的PIN1 S1—S4位點均被磷酸化且對BFA敏感[26]，表明PIN基部定位的磷酸化與D6PKs磷酸化位點偏好無關.

其他AGCVⅢ蛋白激酶如AGC1—3和AGC1—12同樣能夠通過磷酸化PIN蛋白參與調控下胚軸的向光性，但其具體機理尚未清楚[28].此外，AGCVⅢ家族一些成員被證明能夠在體外磷酸化PIN1，如AGC1—5和KIPK，這與在D6PKs和PIDs缺失突變體中仍能觀察到PIN1 S1—S4位點磷酸化的情況相符[26-28].另外，PIDs也能夠激活PIN的生長素輸出活性[25]，可見AGCVⅢ磷酸激酶在多個方面調控PIN的功能.

1.2 CDPK調控PIN在質膜上的分布

CPKs/CDPKs是一種Ca2+感受器，參與Ca2+信號途徑來響應生理反應[34].體外實驗證明馬鈴薯CDPK1(StCDPK1)能夠磷酸化StPIN4[35]，暗示CDPK可能通過介導PIN的磷酸化從而影響植物的生長發(fā)育.CRK(CDPK-related kinase)是Ca2+信號轉導的主要調控因子，是一類絲/蘇氨酸蛋白激酶，擬南芥中共有8個CRK成員，大部分CRK通過調控生長素運輸和信號轉導來影響植物生長發(fā)育[34].2018年，Baba等[36]通過T-DNA敲除所有CRK基因發(fā)現CRK調控PIN2的豐度和定位，表明PIN受CRK蛋白激酶的磷酸化調控，進而參與植物生長發(fā)育.深入研究發(fā)現，AtCRK5在根表皮和皮層細胞的外側質膜上呈明顯的U形分布，在體外能夠直接磷酸化PIN2蛋白，而體內實驗證明AtCRK5通過抑制PIN2的內吞和促進PIN2的再循環(huán)來調控根的向地性反應和生長素極性運輸[37](見圖1)，但其具體磷酸化位點仍然未知.

1.3 MAPK調控PIN極性

擬南芥基因組編碼20個MAPK和10個MAPK激酶(MAPK kinase，MKK)，MKK-MAPK信號級聯通路參與調控很多植物發(fā)育進程[38].MKK7正向調控生長素運輸[39].定點突變PIN1絲氨酸位點S337使其持續(xù)磷酸化，導致PIN1在下胚軸及莖細胞中去極化，表現出和bud1(MKK7過表達突變體)突變體相似表型，證明MKK7下游蛋白激酶MAPK3或MAPK6通過磷酸化PIN1 S337位點介導PIN的極性定位，進而調控植物生長發(fā)育[38].另外，在擬南芥胚胎中突變PIN1 S337及蘇氨酸位點T340導致PIN1失去頂端極性定位，在根表皮細胞中以PIN2啟動子表達磷酸化位點突變的PIN1蛋白能夠挽救pin2突變體表型[40]，推測MKK7-MAPK3/6蛋白激酶級聯介導S337和T340位點磷酸化導致PIN從細胞基部去極化.PIN1 S337和T340在PIN蛋白中并不保守，暗示不同的長PIN蛋白具有不同的極性定位調控機制.最近研究發(fā)現，PIN1的蘇氨酸殘基T227,T248和T286能夠被MAPK4和MAPK6磷酸化，這3個蘇氨酸是高度保守基序“TPRXS(N/S)”的一部分，這些基序也包含S1—S3位點(見圖2)，暗示AGCVⅢ蛋白激酶和MAPK蛋白激酶通過磷酸化PIN的絲氨酸和蘇氨酸位點來介導PIN的極性[41].然而，AGCVⅢ蛋白激酶和MAPK蛋白激酶功能缺失突變體卻具有不同表型.因此，這些蛋白與PIN極性、生長素極性運輸和植物生長之間的調控關系仍有待于進一步研究.

1.4 去磷酸化酶拮抗調控PIN蛋白的磷酸化

PIN通過可逆的磷酸化機制調控自身動態(tài)極性定位[42-43].最先發(fā)現PIN去磷酸化相關蛋白為PP2AA1(A subunit of protein phosphatase 2A)[44]，下調PP2AA1與其功能冗余基因(包括PP2AA2—PP2AA3)造成PIN由質膜基部向頂部定位[45].PP2AA(包括PP2AA1—PP2AA3)、SAL(SAPS domain-like)和FYPP1/3(phytochrome-associated serine/threonine protein phosphatase 1 and 3)分別作為調控亞基和催化亞基形成PP6(protein phosphatase 6，PP2As(protein phosphatase 2A)類似物)全酶復合物，共同調控PIN去磷酸化[46].PP2As其他亞基也被證明能夠直接使PIN1去磷酸化，如TOPP4(type-one protein phosphatase 4)[47].此外，部分亞基(PP2A-C3/4)通過調控PIN的極性，建立生長素濃度梯度的研究也有報道[48].

1.5 PIN蛋白磷酸化調控途徑中的其他參與蛋白

之前的觀點一直認為PIN的極性取決于S1—S3位點是否被PIDs磷酸化，即質膜基部定位的PIN被磷酸化后定位在質膜頂部，直到去磷酸化為止，這一觀點得到一系列實驗的支持[18,22-23,45-47,49-50].然而最新證據表明，不論是質膜頂端還是底端的PIN都顯示S1—S3位點被磷酸化，但對BFA敏感性不同，暗示需要建立一個更復雜的極性定位模型來解釋PIN磷酸化調控.

已有文獻報道，MAB4/ENP/NPY1(macchi-bou 4/enhancer of pinoid/naked pins in yuc mutants 1)能夠和PID互作，影響PIN1在胚胎、子葉原基的極性定位[51-53].突變MAB4的所有同源基因MEL(MEL1，MEL2，MEL3)影響了組織的生長、根的向地性，以及PIN2的定位、豐度和內吞速率(見圖1).MEL蛋白在胚胎和根細胞中極性定位，定位區(qū)域和PIN蛋白基本一致[54-55]，暗示MAB4/MEL可能是極性因子或者幫助非極性PIDs蛋白調控PIN極性定位的調控因子.

下調順反式脯氨酸異構酶Pin1AT(cis/transprolyl isomerase)抑制PID過表達株系的表型，暗示Pin1AT和PID功能拮抗，使PIN1去磷酸化[56].順反式脯氨酸異構酶通過催化T或S前的脯氨酸順反式異構調控蛋白功能.Pin1AT能夠催化PIN1 S337附近的脯氨酸異構，另外，PIN1蘇氨酸位點 T227,T248和T286最近被證明是MPK4或MPK6的靶位點[38,41,56]，這些位點都與脯氨酸殘基相鄰,構成“TPRXS(N/S)”基序(見圖2)，暗示PID決定的PIN1極性定位依賴于PinAT和MKK-MAPK級聯反應.但Pin1AT對PIN1影響具有特異性，可能存在幾種不同的異構酶協同磷酸化機制調控不同PIN的極性定位[56].

2 PIN極性維持的錨定機制

PIN蛋白的質膜極性定位維持是生長素極性輸出的重要調控機制之一,與無極性的質膜蛋白相比，PIN的不同之處在于PIN在質膜上的橫向擴散受到限制.高分辨率顯微鏡分析顯示，PIN1和PIN2在質膜極性定位的區(qū)域上也存在不均勻分布，大部分蛋白成簇聚合(見圖3)，形成直徑為100～200 nm的簇狀聚合體(clusters)，這些簇狀聚合體由鞘脂、固醇和PIN蛋白構成，受固醇結合劑(filipin)干擾，削弱簇化結構[57].另外，一些極性定位在質膜基部或頂部的磷脂酰肌醇也會影響PIN蛋白的極性分布和PIDs的質膜定位[58-59].

簇狀聚合體：簇狀結構；質膜與細胞壁之間棒狀結構為郝式絲；CME：網格蛋白介導的內吞； GNOM介導再循環(huán)及分泌途徑.

圖3 PIN極性定位維持機制[9,14]

此外，植物細胞壁也被證明和PIN在極性區(qū)域錨定有關.通過化學消化或遺傳干擾抑制細胞壁生成會導致PIN1的極性迅速消失；質壁分離的PIN2蛋白會加快橫向擴散速率[60].進一步的研究發(fā)現，植物細胞壁通過郝式絲(Hechtian strands)與質膜連結，抑制質膜蛋白的橫向擴散[61](見圖3).這些研究結果表明，細胞壁參與調控PIN極性定位的維持.然而，極性區(qū)域PIN蛋白成簇狀分布的成因及細胞壁如何分揀錨定蛋白的機制仍需進一步研究.

3 胞內轉運維持PIN的極性定位

PIN簇狀結構及細胞壁錨定都只能減少極性區(qū)域原有PIN的橫向流動，而質膜的流動性和外界環(huán)境刺激均會影響離散分布(非簇狀)的PIN發(fā)生極性變化[57].越來越多的細胞證據表明，胞內運輸，即不斷將錯誤定位的PIN蛋白內吞(endocytosis)與再循環(huán)(recycling)到質膜的極性區(qū)域，是維持PIN極性定位的重要原因之一.

3.1 網格蛋白介導PIN內吞

PIN的胞內運輸比其質膜側向運動更高效快速地改變PIN的定位[57].目前研究顯示，PIN通過網格蛋白介導的內吞(clathrin-mediated endocytosis，CME)途徑從質膜進入胞內[62-66].

網格蛋白需要接頭蛋白AP-2(adaptor protein-2)及其他輔助蛋白(AP180和epsin等)的協同招募才能定位于質膜上，已知AP-2和貨物蛋白結合后發(fā)生構象變化，暴露與網格蛋白結合的結構域，招募網格蛋白到需要內吞的質膜區(qū)域[67].AUXIN-LIKE1/2作為一種新發(fā)現的CME調控因子，在AP-2和貨物蛋白結合之后抑制網格蛋白的招募，從而阻礙幼苗的生長[68].利用BFA處理或Dendra標記AUXIN-LIKE1/2過表達株系的PIN2，發(fā)現網格蛋白介導PIN2的內吞明顯受到抑制[68](見圖3).已知AP-2通過“YxxΦ”基序揀選質膜蛋白內吞，突變PIN2蛋白的酪氨酸(PIN2,Y505)明顯促進PIN橫向擴散[57,67].然而另一研究發(fā)現，定點突變苯丙氨酸基序(PIN1,F165)亦能影響AP蛋白調控PIN1蛋白的轉運及定位[69](見圖2)，暗示網格蛋白介導PIN內吞的復雜性.

3.2 PIN的再循環(huán)途徑

BFA處理實驗表明，定位在TGN/EE(trans-Golgi network/early endosome)的ARF-GEF GNOM(ADP-ribosylation factor guanine-nucleotide exchange factors，GNOM)能夠調控PIN蛋白從內體(endosomes) 再循環(huán)到質膜基部[21,70].PIN1磷酸化抗體檢測BFA處理后的GNM696L和GNWT，發(fā)現GNWT中磷酸化的PIN1明顯少于GNM696L，暗示GNOM通過維持PIN1的磷酸化從而維持PIN1的極性[26].然而，2014年的研究顯示，GNOM定位于高爾基(golgi apparatus)，BFA處理導致GNOM錯誤定位到TGN/EE上[71].對GNOM亞細胞定位認識的改變，支持了GNOM是在早期分泌途徑中調控PIN極性的觀點[72].利用光轉換熒光蛋白Dendra2分析發(fā)現，BFA小體中富集的都是新合成的PIN2，暗示BFA抑制GNOM介導的分泌途徑，而不是PIN的回收途徑[73].之前GNOM在胞內運輸的功能分析都是建立在BFA藥理分析的基礎上，但BFA在細胞學上的功能還存疑.目前已確定GNOM在PIN極性定位中起著關鍵性作用，但GNOM的精確功能仍沒有定論.

利用BFA藥物分析手段還發(fā)現ARF GTPase機制中其他調控因子，例如GNOM-LIKE1[74-75]，BEN1/MIN7[76]，VAN3[77]及最近報道的14-3-3 epsilon[78].擬南芥中存在13個14-3-3蛋白，根據是否具有高度保守的生物功能分為2類，14-3-3 epsilon屬于保守的14-3-3 epsilon組，一共有5個蛋白.下調14-3-3epsilon基因(epsilon，mu，omicron)導致生長素分布模式發(fā)生改變，產生生長素極性運輸缺陷相關的表型；另外，PIN1和PIN2的組織表達也發(fā)生變化，極性減弱，再循環(huán)途徑受到干擾[78].

4 展 望

已知生長素極性運輸在植物配子體發(fā)生、胚胎與果實發(fā)育、側生器官發(fā)生、向性生長和逆境響應中均具有重要的生物學功能，是植物生長發(fā)育的重要調控機制之一.自從擬南芥PIN基因克隆以來，經過20年的研究，人們對PIN的表達調控、極性定位和運輸機制及其生物學功能已有深入的了解.然而，PIN蛋白如何介導生長素極性輸出的分子作用機制至今仍沒有被徹底弄清楚.因此，在PIN介導生長素極性運輸研究領域中亟待解決以下幾個重要科學問題：1)解析PIN蛋白的晶體結構，這是PIN介導生長素極性運輸的核心科學問題或瓶頸問題，也是最關鍵的生化證據；2)PIN極性建立與維持的分子調控機制，這是剖析細胞水平生長素極性流向的重要機制；3)PIN質膜內吞與胞內運輸的分子機制，既是PIN極性建立與維持機制的重要研究內容之一，也是PIN介導生長素極性輸出的重要調控機制之一.堅信隨著這些科學問題的解決，PIN介導的生長素極性輸出的分子機制會更加清晰.