云南省曲靖市食品藥品檢驗檢測中心，云南 曲靖 655000

清開靈注射液為八種中藥組成的復方制劑，呈棕黃色或棕紅色澄明液體，具有清熱解毒、化痰通絡、醒神開竅的功能，臨床用于熱病、神昏、中風偏癱、神志不清、急性肝炎、上呼吸道感染等，收載在2015年版《中國藥典》一部。目前標準采用家兔法進行熱原檢查[1]，該檢查方法所用家兔的飼養(yǎng)時間長，操作繁瑣，實驗結(jié)果受家兔的個體差異影響較大。而細菌內(nèi)毒素檢查法具有靈敏、快速、操作簡便、結(jié)果準確等優(yōu)點，為建立該品種細菌內(nèi)毒素檢查的可行性研究提供數(shù)據(jù)參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器 BET-48G細菌內(nèi)毒素測定儀(天大天發(fā)科技有限公司)；ZH-2BLENDER渦式振蕩器(天津藥典標準儀器廠)。

1.2 試劑與藥品 細菌內(nèi)毒素工作標準品(CSE，批號：1607302，湛江博康海洋生物有限公司)；鱟試劑(TAL，批號1609021、1705041，標示靈敏度0.5 EU/mL，湛江安度斯生物科技有限公司；批號1607270、1708230，湛江博康海洋生物有限公司)；細菌內(nèi)毒素檢查用水(BET水，批號1607050，湛江博康海洋生物有限公司)；清開靈注射液(批號：170521B2、171031D1、171202A2，神威藥業(yè)集團有限公司)。

2 方法和結(jié)果

2.1 鱟試劑靈敏度的復核試驗 根據(jù)鱟試劑靈敏度的標示值(λ)，用BET水分別將CSE溶解并制成2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ四個濃度的內(nèi)毒素標準溶液，每一個濃度平行做4管，同時用BET水做2支陰性對照管。按2015年版《中國藥典》(通則1143)[2-3]對TAL進行標示靈敏度復核，由表1可見，不同廠家鱟試劑靈敏度均符合規(guī)定。

2.2 內(nèi)毒素限值(L)的計算 根據(jù)公式L=K/M，注射劑K=5 EU/kg·h。M為人用每千克體重每小時的最大供試品劑量，根據(jù)說明書清開靈注射液最大劑量為40 mL，中國人均體重按60 kg計算，M=40 mL / 60 kg.1 h=0.667 mL/kg·h,則L=7.5 EU/mL。本品的限值設為每1 mL清開靈注射液中含內(nèi)毒素應小于7.5 EU。

表1 鱟試劑靈敏度復核試驗結(jié)果

2.3 干擾預實驗最大有效稀釋倍數(shù)(MVD)的確定 根據(jù)公式MVD=CL/λ，C為供試品溶液的濃度，L為供試品溶液的內(nèi)毒素限值，MVD= CL/λ=1.0 mL/mL×7.5 EU/mL / 0.50(EU)=15。

2.4 干擾預試驗 將供試品用BET水分別稀釋，制成：原液、5、10、15倍作為供試品系列(NPC)，同時用上述每一個濃度的溶液制備成含1 EU/mL(2λ)濃度的內(nèi)毒素溶液，將此系列溶液作為供試品陽性對照系列(PPC)。用λ為0.50 EU/mL的2個廠家的TAL分別與2個系列溶液反應，每一稀釋度作2支。BET水作陰性對照(NC)，加入2λ濃度的內(nèi)毒素標準溶液作為陽性對照(PC)，從表2可見清開靈注射液存在干擾作用，稀釋15倍時，即不再對試驗產(chǎn)生干擾。見表2、表3。

表2 清開靈注射液干擾預試驗結(jié)果 (批號1609021，λ=0.5 EU/mL)

表3 清開靈注射液干擾預試驗結(jié)果 (批號1607270，λ=0.5 EU/mL)

2.5 干擾試驗 根據(jù)干擾預實驗結(jié)果，取3批清開靈注射液用BET水分別稀釋15倍，用該稀釋液稀釋CSE，配制成細菌內(nèi)毒素濃度為1.0、0.5、0.25、0.125 EU/mL的系列溶液及不含供試品的細菌內(nèi)毒素溶液。每個濃度平行測定4管，分別與TAL反應，同時用供試品溶液和BET水作陰性對照(Tc)，進行干擾試驗，當Tc為陰性時，結(jié)果按公式ES=lg-1(∑Xs/4)和Et=lg-1(∑Xt/4)計算，式中Xs和Xt分別為含和不含清開靈注射液系列各反應終點細菌內(nèi)毒素濃度的對數(shù)值。ES均在0.5～2λ范圍內(nèi)，并且Et在0.5ES-2ES范圍內(nèi)，說明，15倍稀釋后的清開靈注射液在此試驗條件下，對TAL與細菌內(nèi)毒素之間的凝聚反應無干擾作用，符合《中國藥典》的判斷標準。同時，可以確定清開靈注射液對TAL不產(chǎn)生干擾的濃度大于15倍，使用現(xiàn)市售標示靈敏度為0.5～0.03 EU/mL的TAL均可對清開靈注射液進行細菌內(nèi)毒素檢查。見表4、表5。

表4 清開靈注射液干擾試驗結(jié)果 (批號1609021，λ=0.5 EU/mL)

表5 清開靈注射液干擾試驗結(jié)果 (批號1607270，λ=0.5 EU/mL)

2.6 樣品細菌內(nèi)毒素檢查法的驗證 取3個批號的供試品分別用BET水稀釋15倍，使用λ=0.25 EU/mL的2個廠家的鱟試劑進行內(nèi)毒素檢查，并按要求做陽性(PPC、PC)、陰性(NPC、NC)對照，結(jié)果3批清開靈注射液的內(nèi)毒素檢查均符合規(guī)定。見表6。

表6 樣品細菌內(nèi)毒素檢查結(jié)果

3 討論

本研究所有表格中“+”表示陽性，“-”表示陰性。其判斷標準是形成凝膠且倒轉(zhuǎn)180°不變形、不從管壁滑脫者為陽性；未形成凝膠或形成凝膠不堅固、變形并從管壁滑脫者為陰性。

不同批次供試品對不同廠家的鱟試劑的干擾程度可能存在不同，為了避免因鱟試劑造成的判斷失誤。因此在干擾預試驗中使用了2個廠家的鱟試劑，對3 個批次的清開靈注射液進行凝膠限度法內(nèi)毒素檢查，結(jié)果顯示2個廠家生產(chǎn)的鱟試劑檢驗結(jié)果相同，同一廠家不同批次的供試品對鱟試劑的反應結(jié)果也無差異， 因此確定清開靈注射液的最大不干擾濃度為稀釋15倍 。

目前《中國藥典》2015年版并未收錄清開靈注射液，也尚無國家標準對其進行細菌內(nèi)毒素檢查。采用傳統(tǒng)的家兔法檢查熱原，成本高、時間長、影響因素多、靈敏度低。細菌內(nèi)毒素檢查法相比于家兔熱原檢查法，具有經(jīng)濟、快捷、靈敏和易于標準化的優(yōu)點，受到了現(xiàn)代藥品檢驗技術(shù)的青睞。因此，開展清開靈注射液內(nèi)毒素檢查法的研究有著重要的實際意義。

建議 將清開靈注射液質(zhì)量標準中的熱原檢查項改為細菌內(nèi)毒素檢查項，規(guī)定每1 mL清開靈注射液中含內(nèi)毒素的量應小于7.5EU。