許小潔?┱偶濤? 徐德坤 殷復(fù)偉 田延平 李向東

摘要：將甘蔗花葉病毒（Sugarcane mosaic virus，SCMV）第Ⅰ組分離物DWK1和第Ⅳ組分離物DWK2的衣殼蛋白（coat protein，CP）基因分別克隆到原核表達(dá)載體pEHISTEV，得到重組質(zhì)粒pEHISTEV-SCMV-Ⅰ-CP和pEHISTEV-SCMV-Ⅳ-CP。將兩個(gè)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，均表達(dá)出分子量為38 kD的融合蛋白。切膠回收融合蛋白，免疫新西蘭長(zhǎng)耳兔5次，獲得了SCMV-Ⅰ CP和SCMV-Ⅳ CP的多克隆抗體。間接ELISA結(jié)果表明，兩種血清的效價(jià)均達(dá)到1∶8192。Western Blot結(jié)果表明，利用SCMV-ⅠCP制備的抗血清與DWK1反應(yīng)更強(qiáng)，而利用SCMV-Ⅳ CP制備的抗血清與DWK2反應(yīng)更強(qiáng)。本研究為SCMV檢測(cè)及CP功能研究奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：甘蔗花葉病毒；衣殼蛋白；原核表達(dá)；抗血清；檢測(cè)

中圖分類號(hào)：S435.131.4+9：Q78 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2018）08-0106-04

Prokaryotic Expression and Antiserum Preparation of

Sugarcane Mosaic Virus Coat Protein

Xu Xiaojie1，2， Zhang Jiwu1*， Xu Dekun3， Yin Fuwei4， Tian Yanping1， Li Xiangdong1，2

（1. College of Plant Protection， Shandong Agricultural University/Laboratory of Plant Virology， Taian 271018， China；

2. Shandong Provincial Key Laboratory of Agricultural Microbiology， Taian 271018， China；

3. Linyi Plant Protection Station， Linyi 276001， China； 4. Taian Agricultural Technology Station， Taian 271000， China）

Abstract The coat protein （CP） genes of Sugarcane mosaic virus （SCMV） groups Ⅰ （isolate DWK1） and IV （isolate DWK2） were amplified by RT-PCR and cloned into prokaryotic expression vector pEHISTEV， and produced recombinant plasmids pEHISTEV-SCMV-Ⅰ-CP and pEHISTEV-SCMV-Ⅳ-CP. The recombinant plasmids were transformed into Escherichia coli strain Rosetta and could both express a fusion protein with molecular weight of 38 kD after induction with IPTG. The fusion protein was cut from the gel， emulsified and used to immunize the New Zealand long-eared white rabbits five times to produce polyclonal antiserum against SCMV-Ⅰ CP and SCMV-Ⅳ CP. Indirect ELISA results showed that the titers of the two antisera reached 1∶8192. Western Blot results indicated that the antiserum prepared with SCMV-Ⅰ CP showed stronger positive reaction than DWK1， while that prepared with SCMV-Ⅳ CP was more responsive to DWK2. The antiserum prepared here provided solid foundation for the detection of SCMV and the functional studies of SCMV CP.

Keywords Sugarcane mosaic virus； Coat protein； Prokaryotic expression； Antiserum； Detection

矮花葉病是玉米上的一種重要病毒病害。玉米矮花葉病1968年在我國(guó)河南省新鄉(xiāng)、安陽(yáng)一帶發(fā)生[1]，現(xiàn)在我國(guó)玉米主產(chǎn)區(qū)均有分布，是限制玉米持續(xù)高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的重要因素。引起我國(guó)玉米矮花葉病的主要毒原為甘蔗花葉病毒（Sugarcane mosaic virus，SCMV）[2]。

SCMV屬于馬鈴薯Y病毒科（Potyviridae）馬鈴薯Y病毒屬（Potyvirus），可以由蚜蟲傳播，也可通過(guò)種子傳播。SCMV病毒粒體為線狀，長(zhǎng)700～750 nm。其基因組為正單鏈RNA。根據(jù)全基因組序列的系統(tǒng)發(fā)育分析，SCMV分為4個(gè)組，其中第Ⅰ組分布最為廣泛，第Ⅳ組是新發(fā)現(xiàn)的一個(gè)強(qiáng)毒株系，可侵染全部20個(gè)供試玉米品種[3]。第Ⅳ組分離物發(fā)生呈逐年上升趨勢(shì)，最早在河北省發(fā)現(xiàn)，目前山東、湖北等地已出現(xiàn)，國(guó)外東非等地也有報(bào)道[4，5]。

早期檢測(cè)對(duì)SCMV等植物病毒的防治非常關(guān)鍵。血清學(xué)方法具有操作簡(jiǎn)單、特異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，是植物病毒檢測(cè)中最常用的方法。利用提純病毒制備抗血清所需周期長(zhǎng)，有些病毒難以提純或者在植物體內(nèi)濃度很低，無(wú)法獲得高質(zhì)量的抗體。本研究利用大腸桿菌表達(dá)的SCMV CP制備了效價(jià)高、特異性強(qiáng)的抗血清。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

兩個(gè)感染SCMV的玉米樣品均采自山東泰安岱岳區(qū)大汶口鎮(zhèn)（北緯35°57′14.05″，東經(jīng)117°04′58.66″）， 經(jīng)檢測(cè)樣品1中的毒原DWK1屬于SCMV第Ⅰ組，樣品2中的毒原DWK2屬于SCMV第Ⅳ組[6]。

原核表達(dá)載體pEHISTEV和大腸桿菌（Escherichia coli）菌株Rosetta（DE3）均由英國(guó)安德魯斯大學(xué)劉煥庭惠贈(zèng)。大腸桿菌菌株DH5α由本實(shí)驗(yàn)室保存。

限制性核酸內(nèi)切酶、T4 DNA聚合酶、反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、不含RNA酶的雙蒸水、Taq DNA聚合酶、dNTP購(gòu)自TaKaRa公司；Phusion DNA聚合酶、Western Blot所用蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自Thermo公司；植物總RNA提取試劑盒TransZol、PCR產(chǎn)物凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒為TransGen公司產(chǎn)品；硝酸纖維素膜（NC）為Pall Gelman公司產(chǎn)品；堿性磷酸酯酶標(biāo)記的羊抗兔IgG、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鼠抗兔IgG、福氏完全佐劑、福氏不完全佐劑購(gòu)自Sigma公司；IPTG、DTT、甲醇等其它試劑為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)SCMV DWK1和DWK2（登錄號(hào)分別為KU171814和KU171815）全基因組序列，設(shè)計(jì)克隆SCMV Ⅰ和Ⅳ組分離物CP基因的引物，由上海生工生物工程有限公司合成。克隆SCMV-Ⅰ CP的正向引物為SCMVcp-Ⅰ-Nco Ⅰ-F（5′-CATGCCATGGCTTCCGGAACTGTGGATGCAG-3′；下劃線部分為NcoⅠ酶切位點(diǎn)），反向引物為SCMVcp-Ⅰ-EcoRⅠ-R（5′-CCGGAATTCTTAGTGGTGCTGCTGCACTCCC-3′；下劃線部分為EcoRⅠ酶切位點(diǎn)），擴(kuò)增片段預(yù)期大小為939 bp?？寺CMV-Ⅳ組分離物CP的正向引物為SCMVcp-Ⅳ-NcoⅠ-F（5′-CATGCCATGGCTTCTGGTCAAGTTGACGCAGGG-3′；下劃線部分為NcoⅠ酶切位點(diǎn)），反向引物為SCMVcp-Ⅳ-EcoRⅠ-R（5′-CCGGAATTCTTAGTGATGTTGCTGCACTCCCAAC-3′；下劃線部分為EcoRⅠ酶切位點(diǎn)），擴(kuò)增片段預(yù)期大小為939 bp。

1.3 原核表達(dá)載體構(gòu)建及表達(dá)

利用TransZol試劑盒提取感染DWK1和DWK2玉米樣品總RNA，選擇隨機(jī)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA， 利用引物對(duì)SCMVcp-Ⅰ-Nco Ⅰ-F和SCMVcp-Ⅰ-EcoR Ⅰ-R、SCMVcp-Ⅳ-Nco Ⅰ-F和SCMVcp-Ⅳ-EcoRⅠ-R分別擴(kuò)增SCMVⅠ組和Ⅳ組分離物（DWK1和DWK2）的CP基因。PCR程序?yàn)椋?8℃預(yù)變性30 s；98℃變性10 s，65℃退火20 s，72℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離，紫外燈下切取目的條帶，經(jīng)PCR產(chǎn)物凝膠回收試劑盒回收純化后，用NcoⅠ和EcoRⅠ進(jìn)行雙酶切，與相同酶切處理的pEHISTEV載體通過(guò)T4連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌E. coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞。采用PCR、酶切驗(yàn)證篩選陽(yáng)性克隆，由濟(jì)南博尚公司測(cè)序驗(yàn)證。

將測(cè)序驗(yàn)證后的陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)化E. coli菌株Rosetta感受態(tài)細(xì)胞。挑取單菌落用3 mL含50 mg/L卡那霉素的LB培養(yǎng)基于37℃培養(yǎng)12 h，取1 mL菌液加入150 mL含50 mg/L卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)2.5～3.0 h，調(diào)整OD600值為0.4～0.6，加 IPTG至終濃度為100 mmol/L，28℃搖菌5～6 h。經(jīng)4℃、12 000 r/min離心2 min后收集菌體，加適量pH 8.0 TE緩沖液振蕩懸浮，再加入等體積的2×SDS上樣緩沖液，沸水浴5 min，-20℃放置5 min，4℃、12 000 r/min離心10 min，取10 μL上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)蛋白表達(dá)情況。

1.4 抗血清制備、效價(jià)及特異性測(cè)定

原核表達(dá)的蛋白經(jīng)電泳后，用4℃預(yù)冷的含 0.25 mol/L KCl 和1 mmol/L DTT的顯色液進(jìn)行染色，切取目的蛋白條帶于預(yù)冷的研缽中，按1∶1（W/V）加入0.9%生理鹽水充分研磨。初次免疫加等體積的弗氏完全佐劑進(jìn)行乳化，采取皮下多點(diǎn)注射新西蘭長(zhǎng)耳兔，一周后改用弗氏不完全佐劑進(jìn)行蛋白乳化，以后每隔一周注射一次，共5次。最后一次免疫一周后取血，分離血清后，于-20℃長(zhǎng)期保存。

將感染DWK1和DWK2的玉米葉片按1∶10（W/V）的比例加入抗原包被緩沖液（0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液，pH 9.6）充分研磨后，加入酶聯(lián)板中，再以相同的方法處理健康玉米葉片作為陰性對(duì)照。按照1∶26～1∶214對(duì)抗血清進(jìn)行梯度稀釋。顯色后使用酶標(biāo)儀讀取OD405的值，以I（待測(cè)樣品讀數(shù)-空白讀數(shù)）/H（陰性樣品讀數(shù)-空白讀數(shù)）≥2作為陽(yáng)性反應(yīng)。以能出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)的抗體最大稀釋倍數(shù)作為抗血清的效價(jià)[7]。

根據(jù)Towbin等[8]的方法進(jìn)行Western Blot，分析抗血清的特異性。（1）抗血清對(duì)DWK1、DWK2特異性測(cè)定：兩種抗血清均以感染DWK1和DWK2的玉米葉片為檢測(cè)對(duì)象，以健康玉米葉片為陰性對(duì)照。（2）抗血清對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的特異性檢測(cè)：以pEHISTEV-SCMV-Ⅰ-CP、pEHISTEV-SCMV-Ⅳ-CP原核表達(dá)產(chǎn)物為檢測(cè)對(duì)象，以pEHISTEV空載體原核表達(dá)產(chǎn)物為陰性對(duì)照。樣品蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后于4℃轉(zhuǎn)至NC膜，再用5%脫脂奶粉溶液將NC膜4℃封閉過(guò)夜。洗滌后，加入1∶500稀釋的抗血清孵育3 h，洗滌后加入HRP-鼠抗兔IgG稀釋液（1∶50 000稀釋）。將HRP-ECL化學(xué)發(fā)光所用A、B發(fā)光液按1∶1混合，覆于NC膜上，用ChampChemi全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光儀觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 SCMV-Ⅰ和SCMV-Ⅳ CP基因克隆及原核表達(dá)

通過(guò)RT-PCR方法從感染DWK1、DWK2玉米葉片中均克隆到940 bp左右的DNA條帶（圖1），與預(yù)期大小相符。經(jīng)NcoⅠ和EcoRⅠ雙酶切，連接到相同酶切處理的pEHISTEV載體，獲得重組質(zhì)粒pEHISTEV-SCMV-Ⅰ-CP和pEHISTEV-SCMV-Ⅳ-CP。轉(zhuǎn)化E. coli Rosetta，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，通過(guò)SDS-PAGE電泳結(jié)果檢測(cè)目的蛋白表達(dá)情況。含有重組質(zhì)粒pEHISTEV-SCMV-Ⅰ-CP和pEHISTEV-SCMV-Ⅳ-CP的Rosetta細(xì)胞表達(dá)出了分子量在38 kD左右的蛋白，與預(yù)期大小一致，而攜帶pEHISTEV空載體的Rosetta細(xì)胞中沒(méi)有該蛋白（圖2），表明SCMV CP基因在大腸桿菌中得到了正確表達(dá)。

2.2 抗血清制備及效價(jià)測(cè)定

原核表達(dá)的CP蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離，用KCl染色后切膠回收，乳化后經(jīng)皮下多點(diǎn)注射免疫新西蘭長(zhǎng)耳兔，注射5次后獲得SCMV-Ⅰ和SCMV-Ⅳ CP的抗血清。分別用相應(yīng)的抗原測(cè)定抗血清的效價(jià)，陰性對(duì)照均為健康玉米葉片。間接ELISA結(jié)果表明，在病汁液稀釋10倍時(shí)，利用原核表達(dá)的DWK1和DWK2 CP制備的抗體效價(jià)均可達(dá)到1∶8192（如表1）。

2.3 抗血清特異性檢測(cè)

Western Blot分析顯示，利用本研究制備的抗血清分別檢測(cè)pEHISTEV-SCMV-Ⅰ-CP和pEHISTEV-SCMV-Ⅳ-CP的原核表達(dá)產(chǎn)物時(shí)，均在分子量38 kD處出現(xiàn)一條特異性條帶（圖3），與SDS-PAGE中CP蛋白的大小一致；兩種血清與DWK1、DWK2均存在特異性反應(yīng)，但與相對(duì)應(yīng)的抗原反應(yīng)更強(qiáng)烈（利用原核表達(dá)的SCMV-Ⅰ CP制備的抗血清和DWK1反應(yīng)更強(qiáng)，而用原核表達(dá)的SCMV-ⅣCP制備的抗血清和DWK2反應(yīng)更強(qiáng)），兩種血清與健康寄主汁液無(wú)反應(yīng)（圖4），說(shuō)明制備的抗血清有較好的特異性。

3 討論與結(jié)論

陳啟建等[9]利用提純SCMV病毒免疫家兔制備抗血清，其效價(jià)為1∶1024。李向東等[10]利用原核表達(dá)的SCMV CP制備的抗體效價(jià)可以達(dá)到1∶2048。本研究利用原核表達(dá)的CP制備了SCMV第Ⅰ組和第Ⅳ組分離物CP的抗體，效價(jià)可達(dá)1∶8192。

因?yàn)镾DS的作用，SDS-PAGE分離蛋白時(shí)造成了蛋白的變性。利用切膠回收的蛋白制備的抗體有時(shí)候只能用于Western Blot分析，而不能用于ELISA檢測(cè)。本研究制備的抗體可以用于ELISA 檢測(cè)，而且效價(jià)達(dá)到1∶8192。

SCMV第Ⅳ組分離物是近年新出現(xiàn)的，和其它組分離物的CP氨基酸序列差異較大[3，5]。利用SCMV第Ⅰ組分離物DWK1和第Ⅳ組分離物DWK2 CP制備的抗體有交叉反應(yīng)，但又有明顯不同。兩種血清具有互補(bǔ)性，如果聯(lián)合使用，可以提高SCMV的檢出成功率，減少漏檢。

本研究制備的抗血清為監(jiān)測(cè)SCMV發(fā)生情況奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

參 考 文 獻(xiàn)：

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