陽(yáng)洪波，王韋達(dá)，李 意，劉奕雄，朱宇薇，杜業(yè)剛*，楊國(guó)武*

(1.深圳市計(jì)量質(zhì)量檢測(cè)研究院，廣東 深圳 518109；2.深圳大學(xué)西麗校區(qū)測(cè)試中心，廣東 深圳 518055；3.深圳明德實(shí)驗(yàn)學(xué)校，廣東 深圳 518034)

膠原蛋白是動(dòng)物體內(nèi)含量相對(duì)最多、分布最廣的蛋白質(zhì)(占動(dòng)物體內(nèi)總蛋白含量的25%～33%)，根據(jù)每條肽鏈上的氨基酸序列及交聯(lián)方式不同，膠原蛋白有很多種類(lèi)型[1]。目前，至少有28種不同類(lèi)型的膠原蛋白[2]，其中Ⅰ型是人和動(dòng)物中最豐富及最為廣泛研究的膠原蛋白，大部分存在于皮膚、肌腱、角膜等結(jié)締組織中，約占生物體全部膠原的80%～90%[3]；Ⅱ型主要存在于軟骨、玻璃體和椎間盤(pán)；Ⅲ型主要存在于新生皮膚、血管和網(wǎng)狀纖維等組織中，Ⅵ型主要存在于真皮、軟骨、胎盤(pán)等組織中[4]。膠原蛋白作為一種天然的生物原料，其高度的生物相容性、可降解性以及生物活性使之在醫(yī)藥、食品、保健品、攝影、化妝品、皮革、造紙等領(lǐng)域中應(yīng)用廣泛[5-6]。膠原蛋白主要來(lái)源于動(dòng)物的皮、骨或筋腱等組織，其中來(lái)源于豬牛羊最為常見(jiàn)，且易于獲得，所以本實(shí)驗(yàn)主要選擇豬牛羊3種動(dòng)物進(jìn)行研究。近年來(lái)瘋牛病和口蹄疫的發(fā)生以及食物過(guò)敏的危險(xiǎn)使人們備加關(guān)注膠原蛋白的動(dòng)物來(lái)源[7]；另外，由于宗教因素，虔誠(chéng)的宗教徒們對(duì)食物有嚴(yán)格的限制，猶太教和伊斯蘭教禁忌豬及其制品，印度教禁忌牛及其制品[8]。而中國(guó)藥典對(duì)阿膠、鹿角膠、龜甲膠等傳統(tǒng)名貴膠類(lèi)藥材的動(dòng)物來(lái)源有嚴(yán)格的要求，但這些中藥材因生產(chǎn)原料資源有限，價(jià)格昂貴，有不法廠商為降低成本向其中摻入牛皮源、豬皮源或羊皮源原料[9-10]。因此,建立膠原蛋白動(dòng)物來(lái)源的鑒別方法具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

不同動(dòng)物的膠原蛋白具有較高的同源性，導(dǎo)致其光譜性質(zhì)和理化性能差異不顯著，因此鑒別其物種來(lái)源十分困難，文獻(xiàn)報(bào)道膠原蛋白的鑒定方法有電泳法[11-12]、免疫學(xué)方法[13]和質(zhì)譜技術(shù)[14]。電泳法的自動(dòng)化程度低、蛋白質(zhì)易丟失，對(duì)強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、難溶、低豐度的蛋白質(zhì)分離效果差。酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)一次只能檢測(cè)單個(gè)蛋白質(zhì)，不能同時(shí)檢測(cè)多個(gè)物種，反應(yīng)特異性差?；诟咄亢透叻直媛寿|(zhì)譜技術(shù)，結(jié)合蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)分析不同物種蛋白質(zhì)的方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、可靠，近年來(lái)已成為蛋白質(zhì)鑒定的主要方法。由于不同物種蛋白質(zhì)的氨基酸序列存在差異，通過(guò)序列差異鑒別膠原蛋白是一種潛在的追溯其物種來(lái)源的方法。肽質(zhì)量指紋圖譜(Peptide mass fingerprinting，PMF)是一種蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)[15-16]，但基于PMF的蛋白鑒定依賴(lài)單一蛋白，混合蛋白會(huì)使PMF的分析復(fù)雜化，并可能得到不正確的結(jié)果，對(duì)于含有超過(guò)2～3種蛋白樣品的PMF鑒定，需額外使用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)技術(shù)以提升蛋白鑒定的特異性。基于特征肽段的質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)多用于鑒別蛋白的來(lái)源，Kumazawa等[17]基于LC-MS，利用膠原蛋白特征肽段鑒別皮革的動(dòng)物源性，結(jié)果顯示只有羊的特征肽段具有特異性，未找到牛、馬、豬、鹿的膠原蛋白特征肽段。Li等[18]先通過(guò)生物信息學(xué)的方式尋找鑒別幾個(gè)物種膠原蛋白的理論肽段，再利用LC-MS/MS分析與理論肽段匹配，結(jié)合高分辨質(zhì)譜確證，選擇實(shí)際樣品中能檢測(cè)到的特征肽段進(jìn)行研究。由于前處理、肽段含量或肽段穩(wěn)定性等因素，很多理論上存在的特征肽段在實(shí)際樣品可能檢測(cè)不到，增加了鑒定的工作量，且多反應(yīng)監(jiān)測(cè)方法(MRM)僅掃描1個(gè)子離子，易產(chǎn)生假陽(yáng)性峰。

本研究利用納升液相色譜-串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜(nanoLC-TOF-MS)對(duì)豬皮、牛皮和羊皮樣品中的蛋白和多肽進(jìn)行分離鑒定，數(shù)據(jù)經(jīng)ProteinPilotTM軟件與UniProt蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比分析，篩選出實(shí)際樣品中能檢測(cè)到的豬、牛和羊膠原蛋白潛在的特征肽段后在美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(NCBI)網(wǎng)站上進(jìn)行blast分析，進(jìn)一步確認(rèn)其特異性；采用四極桿/線性離子阱串聯(lián)質(zhì)譜(QTRAP-MS)獨(dú)特的MRM-IDA-EPI模式，建立MRM方法，并結(jié)合MRM觸發(fā)的增強(qiáng)子離子掃描(Enhanced product ion，EPI)方式進(jìn)一步確認(rèn)肽段序列，從而可有效消除假陽(yáng)性的MRM峰，增加了檢測(cè)結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性。該方法操作簡(jiǎn)便，在膠原蛋白的動(dòng)物來(lái)源鑒別中具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

TripleTOF?6600飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(配納升電噴霧電離源和EksigentnanoLC-Ultra?液相系統(tǒng))，QTRAP?6500+四極桿/線性離子阱串級(jí)質(zhì)譜(美國(guó)AB Sciex公司)；Waters AcquityTM超高效液相色譜儀(UPLC，美國(guó)Waters公司)；5424R型冷凍離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)；DNP-9272型電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；SK2510LHC型超聲波萃取儀(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)；CPA224S型萬(wàn)分位分析天平(德國(guó)賽多利斯公司)；HV-110型自動(dòng)高壓滅菌器(日本Hirayama公司)；KS4000i型空氣控溫?fù)u床(德國(guó)IKA公司)；Trap柱Eksigent C18(350 μm×0.5 mm，3 μm)、分析柱Eksigent C18(75 μm×150 mm，3 μm)(美國(guó)AB SCIEX公司)；分析柱Eclipse Plus C18(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)(美國(guó)Agilent公司)；10 kDa超濾離心管(德國(guó)賽多利斯公司)。

TPCK-胰蛋白酶(序列分析級(jí)，美國(guó)Sigma-Aldrich公司)；乙腈、水(質(zhì)譜純，德國(guó)Merck公司)；甲酸(質(zhì)譜純，美國(guó)Thermo Fisher公司)；尿素、3-[3-(膽酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸內(nèi)鹽(CHAPS)、二硫蘇糖醇(DTT)、碘乙酰胺(IAA，美國(guó)Amresco公司)；硫脲(美國(guó)Sigma-Aldrich公司)；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 樣品采集

豬皮、牛皮和羊皮均購(gòu)自當(dāng)?shù)卣?guī)的商業(yè)屠宰場(chǎng)。剔除皮樣品中的毛及肌肉組織后將其分割成小塊，凍干后于-20 ℃保存，待用。

1.3 蛋白質(zhì)的提取

分別稱(chēng)取豬皮、羊皮和牛皮各1 g高溫高壓處理1 h(121 ℃，0.1 MPa)，加入5 mL蛋白提取液(7 mol/L 尿素，2 mol/L硫脲，40 g/L CHAPS)，振蕩過(guò)夜。于12 000 r/min離心20 min，取上清液備用。采用Bradford法測(cè)定蛋白濃度。

1.4 蛋白樣品前處理

根據(jù)測(cè)定的蛋白濃度，取適量上清液轉(zhuǎn)移至低吸附離心管中，補(bǔ)加尿素(8 mol/L)至100 μL，加2 μL二硫蘇糖醇(1 mol/L)，37 ℃反應(yīng)1 h，還原二硫鍵，然后加入10 μL碘乙酰胺(1 mol/L)室溫避光反應(yīng)30 min，進(jìn)行烷基化處理。將樣品溶液轉(zhuǎn)移至超濾離心管中(截留分子量為10 kDa)，離心過(guò)量的DTT、IAA和部分雜質(zhì)，并用碳酸氫銨(50 mmol/L)溶液置換3次；向超濾管中加入100 μL測(cè)序級(jí)胰蛋白酶(1∶80，質(zhì)量比)，搖勻，37 ℃酶解過(guò)夜，離心收集濾液。

1.5 特征肽段的篩選

1.5.1色譜條件色譜柱：Trap柱Eksigent C18(350 μm×0.5 mm，3 μm)，分析柱Eksigent C18(75 μm×150 mm，3 μm)；流動(dòng)相：A為0.1%甲酸水-乙腈溶液(98∶2，體積比)，B為0.1%甲酸乙腈-水溶液(98∶2，體積比)；梯度洗脫程序：0～0.5 min，95%～93%A；0.5～40 min，93%～78%A；40～70 min，78%～65%A；70～75 min，65%～20%A；75～80 min，20%A；80～81 min，20%～95%A；81～90 min，95%A；流速：300 nL/min；進(jìn)樣量：6 μL。

1.5.2質(zhì)譜條件采用TOF-MS系統(tǒng)結(jié)合納升噴霧電離源，噴霧電壓2 300 V，氣簾氣：207 kPa(30 psi)，霧化氣：41 kPa(6 psi)，加熱溫度150 ℃，質(zhì)譜掃描方式為信息依賴(lài)的采集工作模式(Information dependent analysis，IDA)。一級(jí)TOF-MS單張圖譜的掃描時(shí)間為250 ms，每次IDA循環(huán)下，最多采集30張電荷為2+～5+且單秒計(jì)數(shù)大于150的二級(jí)質(zhì)譜，每張二級(jí)質(zhì)譜的累積時(shí)間為50 ms。

1.5.3數(shù)據(jù)分析對(duì)質(zhì)譜采集到的原始.wiff圖譜文件，采用ProteinPilot 5.0軟件進(jìn)行檢索分析。參數(shù)設(shè)置如下：半胱氨酸烷基化為碘乙酰胺修飾、胰蛋白酶酶解，數(shù)據(jù)庫(kù)為Uniprot-Mammlia，檢索方式為徹底檢索分析。

1.6 MRM質(zhì)譜方法的建立

1.6.1色譜條件色譜柱：Eclipse Plus C18(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量2 μL；流速：300 μL/min；流動(dòng)相：A為乙腈，B為1%甲酸水溶液；梯度洗脫程序：0～10 min，5%～15%A；10～11 min，15%～80%A；11～13.5 min，80%A；13.5～14.5 min，80%～5%A；14.5～18 min，5%A。

1.6.2質(zhì)譜條件離子源：電噴霧離子源(ESI)；掃描模式：正離子掃描，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)觸發(fā)增強(qiáng)子離子掃描(MRM-IDA-EPI)模式；噴霧電壓：5 500 V；離子源溫度：550 ℃；氣簾氣：276 kPa(40 psi)；霧化氣：379 kPa(55 psi)；反吹氣：379 kPa(55 psi)；MRM質(zhì)譜采集參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 MRM質(zhì)譜采集參數(shù)Table 1 MRM mass spectrometric acquisition parameters

P*:prolinehydroxylation(脯氨酸羥基化)；PM：pig collagen peptide marker(豬膠原蛋白特征肽段)；CM：cattle collagen peptide marker(牛膠原蛋白特征肽段)；SM：sheep collagen peptide marker(羊膠原蛋白特征肽段)

2 結(jié)果與討論

2.1 豬牛羊膠原蛋白特征肽段的篩選

采用納升液相色譜-串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜分析胰蛋白酶酶解后的豬皮、牛皮和羊皮多肽樣品，數(shù)據(jù)經(jīng)ProteinPilotTM軟件與UniProt蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比分析。通過(guò)比較各個(gè)物種皮類(lèi)鑒定的蛋白質(zhì)和肽段列表，找到只在豬皮、牛皮或羊皮樣品中的特征肽段，這些特征肽段可作為豬、?；蜓虻奶禺悩?biāo)志物，且這些肽段對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)在此3個(gè)物種中均能鑒定到，只是肽的氨基酸序列有差別。最后將這些特征肽段在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行blast分析，排除自身存在而未檢測(cè)到的肽段或其他可能物種的肽段干擾，進(jìn)一步確認(rèn)其特異性，即這些肽的氨基酸序列不能與其他幾個(gè)物種100%匹配。經(jīng)過(guò)蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定篩選及blast分析，豬、牛和羊的特征肽段信息見(jiàn)表2，鑒定到豬、牛、羊的特征肽段主要來(lái)源于膠原蛋白Ⅰ型的α1鏈和α2鏈，其中羊膠原蛋白Ⅰ型α2鏈的特征肽段“GPAGPTGPAGK”，以及豬膠原蛋白Ⅵ型α2鏈和α3鏈的3條特征肽段“LFAVPPNLQLNEQGLR”、“DILTESAGSR”和“VVIHFTDGADGDLADLQR”均未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。豬膠原蛋白特征肽段“TGETGASGPP*GFAGEK”和牛膠原蛋白特征肽段“SGETGASGPP*GFVGEK”存在脯氨酸羥基化修飾位點(diǎn)，羥脯氨酸作為膠原蛋白的特異性氨基酸，含量穩(wěn)定，約占總膠原蛋白的7%～10%，且在其它動(dòng)物蛋白質(zhì)中含量極微[19]，因此選擇有脯氨酸羥基化修飾位點(diǎn)的肽段作為鑒別膠原蛋白的特征肽段具有很強(qiáng)的特異性。膠原蛋白中脯氨酸的含量?jī)H次于甘氨酸，且脯氨酸和羥脯氨酸的含量與膠原蛋白的穩(wěn)定性、變性溫度呈正相關(guān)[20]，而鑒定到的肽段大部分均含有多個(gè)脯氨酸，故能在高溫高壓等嚴(yán)苛的處理過(guò)程中穩(wěn)定存在，不受膠原蛋白生產(chǎn)制備工藝的影響。在尋找豬皮、牛皮、羊皮的潛在特征肽段時(shí)，排除了鑒定蛋白中置信度(ProteinPilot軟件自動(dòng)給出)小于95%的肽段，增加了特征肽段的可靠性。另外，由于胰蛋白酶酶切效率的影響，會(huì)出現(xiàn)過(guò)切或漏切等現(xiàn)象[21]，篩選潛在特征肽段時(shí)，應(yīng)及時(shí)排除存在過(guò)切或漏切位點(diǎn)的特征肽段，同時(shí)避免選擇出現(xiàn)天冬酰胺脫酰胺、谷氨酸N-末端環(huán)化、甲基化和磷酸化等不穩(wěn)定存在的肽段。

表2 豬、牛和羊的特征肽段Table 2 Marker peptides of pig，cattle and sheep

P*：proline hydroxylation(脯氨酸羥基化)

圖1 豬牛羊膠原蛋白特征肽段的MRM提取離子流圖Fig.1 MRM chromatograms of pig，cattle and sheep collagen marker peptideA：cattle skin，B：pig skin，C：sheep skin，PM：pig collagen marker peptide，CM：cattle collagen marker peptide，SM：sheep collagen marker peptide，ion mass charge ratios shows in Table 1

2.2 豬牛羊膠原蛋白特征肽段的特異性驗(yàn)證

通過(guò)高分辨質(zhì)譜及數(shù)據(jù)庫(kù)檢索篩選到的特征肽段，必須經(jīng)質(zhì)譜MRM檢測(cè)方法進(jìn)一步驗(yàn)證其特異性。采用超高效液相色譜四極桿/線性離子阱串聯(lián)質(zhì)譜建立了MRM-IDA-EPI檢測(cè)方法，利用Skyline軟件構(gòu)建豬皮、牛皮和羊皮特征肽段的MRM離子對(duì)，優(yōu)化DP、CE等質(zhì)譜參數(shù)，然后在豬皮、牛皮、羊皮樣品中逐一進(jìn)行篩選和確認(rèn)。與文獻(xiàn)[17-18]方法相比，本方法通過(guò)多個(gè)MRM離子對(duì)、MRM觸發(fā)EPI掃描方式以及保留時(shí)間進(jìn)一步確認(rèn)肽段序列，有效消除了假陽(yáng)性的MRM峰，增加了檢測(cè)結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性。從實(shí)際樣品中尋找特征肽段，結(jié)合UniProt蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)信息及blast分析，簡(jiǎn)化了肽段特異性驗(yàn)證工作。研究發(fā)現(xiàn)，豬膠原蛋白Ⅵ型的3條特征肽段在豬皮樣品中的響應(yīng)較弱，可能原因是膠原蛋白Ⅰ型約占生物體全部膠原的80%～90%，而膠原蛋白Ⅵ型在豬皮中的含量較低，為保證鑒別結(jié)果的重現(xiàn)性及靈敏度，應(yīng)選擇高豐度蛋白對(duì)應(yīng)的肽，因此不選擇豬膠原蛋白Ⅵ型的3條特征肽段作為鑒定膠原蛋白物種來(lái)源的特征肽段。豬、牛、羊Ⅰ型膠原蛋白特征肽段優(yōu)化后的MRM質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1，根據(jù)“1.6”的檢測(cè)方法，在豬皮、牛皮、羊皮樣品中分別篩選確認(rèn)，豬牛羊膠原蛋白特征肽段的MRM提取離子流圖見(jiàn)圖1。豬膠原蛋白特征肽段只在豬皮樣品中出峰，牛皮和羊皮樣品中無(wú)明顯的色譜峰；羊膠原蛋白特征肽段只在羊皮樣品中出峰，豬皮和羊皮樣品中無(wú)明顯的色譜峰；牛膠原蛋白特征肽段CM2、CM3和CM4只在牛皮樣品中出峰。其中羊皮樣品中保留時(shí)間為1.5 min處的色譜峰與牛膠原蛋白特征肽段CM1在牛皮樣品中保留時(shí)間(tR=1.34 min)接近，將肽段CM1在牛皮樣品中的EPI質(zhì)譜圖(tR=1.34 min)和羊皮樣品中的EPI質(zhì)譜圖(tR=1.5 min)進(jìn)行比較(圖2)，發(fā)現(xiàn)肽段CM1在牛皮樣品中的EPI質(zhì)譜圖出現(xiàn)明顯的y1～y7離子，而在羊皮樣品中無(wú)y7離子m/z668.2，m/z329.2和m/z554.2，雖然與y3和y5離子有相同質(zhì)荷比，但各自的同位素峰強(qiáng)度不同，因此通過(guò)肽段CM1的保留時(shí)間和EPI質(zhì)譜圖可知，羊皮樣品中出現(xiàn)的肽段CM1色譜峰為假陽(yáng)性MRM峰。豬、牛、羊的膠原蛋白特征肽段只分別在豬皮、牛皮、羊皮樣品中出峰。結(jié)果表明豬、牛、羊的特征肽段具有特異性和專(zhuān)屬性。

圖2 牛膠原蛋白特征肽段在不同樣品中的EPI質(zhì)譜圖Fig.2 EPI spectra of cattle collagen marker peptide for different samplesA：cattle skin，tR=1.34 min;B：sheep skin，tR=1.5 min

2.3 方法應(yīng)用

運(yùn)用建立的方法檢測(cè)食用明膠、黃明膠和阿膠中膠原蛋白的動(dòng)物來(lái)源，其MRM提取離子流圖如圖3所示，由于食用明膠的原料主要來(lái)源于豬、牛和羊等動(dòng)物的皮、骨和筋腱等組織，因此豬、牛、羊的特征肽段均有檢出，但由于骨和筋腱中也含有膠原蛋白，且各組織的含量比例不確定，所以食用明膠中豬牛羊膠原蛋白特征肽段的相對(duì)強(qiáng)度和對(duì)應(yīng)的皮的強(qiáng)度不一致，肽段SM1、PM2和CM4的響應(yīng)較低。黃明膠來(lái)源于?？苿?dòng)物黃牛的皮，因此只有牛膠原蛋白特征肽段有檢出，且其相對(duì)強(qiáng)度與牛皮的強(qiáng)度保持一致。豬和羊膠原蛋白特征肽段的保留時(shí)間處未檢測(cè)到明顯的色譜峰。食用明膠和黃明膠的制備工藝中均有長(zhǎng)時(shí)間蒸煮熬膠的步驟，而本研究篩選的特征肽段在這類(lèi)樣品中均有一定的響應(yīng)，說(shuō)明這些肽段具有良好的熱穩(wěn)定性，該檢測(cè)方法可以鑒別食用明膠和黃明膠膠原蛋白的動(dòng)物來(lái)源。阿膠來(lái)源于馬科動(dòng)物驢的皮，2015年版《中國(guó)藥典》采用高效液相色譜-質(zhì)譜法，選擇肽段“GPP*GAAGPP*GP*R”作為特征肽段鑒別阿膠[22]，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在阿膠樣品中只檢測(cè)到阿膠的特征肽段，豬牛羊膠原蛋白特征肽段的保留時(shí)間處未檢測(cè)到明顯的色譜峰，說(shuō)明該方法可用于阿膠中摻入豬皮源、牛皮源或羊皮源成分的鑒別檢測(cè)。

圖3 食用明膠(A)、黃明膠(B)和阿膠(C)中豬牛羊膠原蛋白特征肽段的MRM提取離子流圖Fig.3 MRM chromatograms of pig，cattle and sheep collagen marker peptide for edible gelatin(A)，oxhide gelatin(B) and collacoriiasini(C)PM：pig collagen marker peptide，CM：cattle collagen marker peptide，SM：sheep collagen marker peptide，ion mass charge ratios show in Table 1

3 結(jié) 論

本研究采用nanoLC-TOF-MS系統(tǒng)和ProteinPilotTM軟件篩選出豬牛羊膠原蛋白的潛在特征肽段；利用QTRAP-MS建立了豬牛羊膠原蛋白特征肽段的MRM-IDA-EPI檢測(cè)方法，最終確認(rèn)了3種豬源性膠原蛋白特征肽段，4種牛源性膠原蛋白特征肽段，1種羊源性膠原蛋白特征肽段，其中羊源性膠原蛋白特征肽段“GPAGPTGPAGK”未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道，且篩選的特征肽段能在高溫高壓處理過(guò)程中穩(wěn)定存在，不受膠原蛋白生產(chǎn)制備工藝的影響。MRM觸發(fā)的EPI掃描方式可以進(jìn)一步確認(rèn)肽段的序列，從而有效避免假陽(yáng)性，增加檢測(cè)結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性。本方法為追溯膠原蛋白物種來(lái)源提供了一種快速、穩(wěn)定、靈敏、特異的檢測(cè)技術(shù)，可應(yīng)用于檢測(cè)阿膠、鹿角膠和龜甲膠等名貴膠類(lèi)藥材中是否摻入牛皮源、豬皮源或羊皮源等原料，也可應(yīng)用于食用明膠、黃明膠等膠原蛋白的物種來(lái)源鑒別，為膠原蛋白的市場(chǎng)監(jiān)督提供了高效、有力的技術(shù)支撐。