裴明潤，趙曉帆，朱 琪，劉昌昊，張永健，肖光宗，陳鑫麟

(國防科技大學(xué) 前沿交叉學(xué)科學(xué)院，湖南 長沙 410072)

紅細胞是血液中數(shù)量最多的一種血細胞，也是為生物體運送氧氣的主要媒介. 正常紅細胞在其生命周期中需要反復(fù)經(jīng)過比自身小的毛細血管. 臨床研究表明，紅細胞形變能力異常是一些疾病的發(fā)病機理與病程發(fā)展中的重要環(huán)節(jié). 因此研究紅細胞的形變能力對病理研究和微觀損傷機理等具有十分重要的意義[1-2].

光鑷是以激光作為光源，利用光的力學(xué)效應(yīng)捕獲和處理微觀粒子的三維光學(xué)勢阱[3]. 由于其具有無探測硬傷、非接觸操控的特點，光鑷已經(jīng)成為探測生物細胞結(jié)構(gòu)的有效實驗工具之一[4-6].

本文基于單光束光鑷實現(xiàn)了雞血紅細胞的捕獲和操縱，并選取了無特定病原公雞的雞血紅細胞，利用1 064 nm激光單光束光阱研究在捕獲雞血紅細胞方面的特點，結(jié)合實驗現(xiàn)象得出以雞血紅細胞為代表的結(jié)構(gòu)復(fù)雜、體積較大的生物細胞能夠單個或多個被光鑷捕獲并操控，并且進一步驗證了單光束光鑷在捕獲微粒方面的特點.

1 材料與方法

1.1 雞血紅細胞

紅細胞體積很小，直徑只有7～8 μm，形如圓盤，中間下凹，邊緣較厚. 它具有彈性和可塑性，正常紅細胞在外力作用下具有變形能力. 雞屬于鳥類，新陳代謝旺盛，因而血液中血紅細胞數(shù)目較多，且體積略大于其他生物紅細胞. 綜合考慮，在本實驗中選用雞血紅細胞更利于觀察細胞受力而被捕獲的現(xiàn)象和過程.

1.2 制備細胞懸液

雞血紅細胞在獲取和制備時需要著重考慮抗凝、濃度和純度等方面的影響，因此通過以下步驟制備體積分數(shù)為1%的雞血紅細胞懸液.

1)為避免有些雞的紅細胞有自凝現(xiàn)象，因此配制1%細胞懸液時選擇采取3只無特定病原的公雞的血液各1 mL，分別導(dǎo)入含有抗凝劑EDTA的3只醫(yī)用采血管內(nèi).

2)參考人體血紅細胞的分離技術(shù)，通過以下方式實現(xiàn)對雞血紅細胞的分離. 將抗凝血緩慢注入離心管內(nèi)，蓋好蓋子后將離心管放入離心機，配平后以1 500 r/min的角速度離心5 min，分離出抗凝劑和血漿等. 將第1次離心后的上層液體及白細胞層用注射器吸出，加入適量磷酸緩沖鹽溶液(PBS)，配平后進行第2次離心，以1 500 r/min的角速度離心5 min，進一步清洗紅細胞. 反復(fù)幾次直至上層清液清亮透明為止.

3)取出最后離心后的上層清液，量取99 mL的PBS緩沖液加入100 mL容量瓶中. 用注射器吸取1 mL洗凈的紅細胞，緩慢加入99 mL的PBS緩沖液中，塞緊瓶塞，搖勻即可使用.

4)取稀釋好的雞血紅細胞制作臨時裝片. 在實驗過程中由于激光功率和照明光源的功率較大，會在5 min內(nèi)將臨時裝片內(nèi)的液體蒸發(fā)，而導(dǎo)致裝片內(nèi)細胞失水失活，粘連在裝片玻璃表面上，無法進行操作. 故可采用膠封等形式減少液體蒸發(fā)，以便延長單個裝片的實驗時間.

1.3 光鑷對細胞的作用原理

光鑷是利用激光微束的動力學(xué)效應(yīng)實現(xiàn)的. 從原理上說光鑷是激光與微粒之間復(fù)雜的交互作用. 在所研究的微粒的半徑遠大于光波長時，幾何光學(xué)模型是合理的近似，在這種近似下，入射光可以看成是由許多光線組成的光束，而光阱對微粒的作用力可以看成是所有的光線對微粒的作用力的總和. 光線照射到微粒上時，會發(fā)生折射和反射，光的動量有一部分會傳遞給微粒，圖1給出了1條光線入射到透明小球上的折射和反射情況. 假設(shè)該光線具有功率P，以入射角θ入射到小球上，折射角為r. 由于光線折射進入小球后在小球的內(nèi)部多次反射，因此散射光是所有的這些光的總稱. 這些光線的功率分別為PR，PT2，PT2R，…，PT2Rm，其中R和T分別為光強的反射和透射系數(shù). 因此，在入射光方向也就是z方向上，小球單位時間內(nèi)受到的動量變化可以由動量定理得出，經(jīng)過化簡，得[7-8]

(1)

同理，可以計算出y方向小球的受力為

(2)

圖1 光線入射到透明小球示意圖

如圖2所示，當(dāng)有1束平行光穿過小球時，各光線分別對小球產(chǎn)生梯度力和散射力的作用. 可以用2條相對于光軸對稱的光線A和B表示整個平行光束，當(dāng)這2條光線入射到球體上時，將產(chǎn)生反射和折射，從而分別產(chǎn)生光阱力FA和FB. 在橫向方向，假設(shè)光強自左向右逐漸減小，即光線A的光強大于光線B，此時光阱力FA在橫向上的分量大于FB，微球受到總的橫向光阱力方向向左，也就是說小球具有向光強較大處移動的特性，該特性正比于光強梯度，因此稱之為梯度力. 在軸向方向，小球?qū)⑹艿缴⑸淞κ沟眯∏蜓毓馐鴤鞑シ较蛞苿? 如果采用非平行光束使得光束在某一徑向位置處光強最大，粒子將在縱向被捕獲. 若把一定強度和模式的激光會聚到μm量級，則微粒將受到指向光強最強點(即焦點)的梯度力. 單光束光鑷通過高倍率的物鏡產(chǎn)生強梯度場，因而梯度力遠大于散射力和微球重力，使得微球在梯度力的作用下被捕獲于光強最大處，即焦點位置. 當(dāng)梯度力與散射力平衡時，微粒能穩(wěn)定地被束縛在光束焦點附近，隨著焦點的移動而移動.

圖2 透明小球受力示意圖

1.4 實驗裝置

實驗用光鑷所采用的激光源為1 064 nm單模光纖激光器，激光經(jīng)擴束器、分色鏡、顯微物鏡后會聚于樣本表面. 實驗裝置采用觀察光路和光鑷激光光路共光路設(shè)計的倒置式顯微鏡，使用CMOS圖像傳感器(Thorlabs DC1245M)成像便于觀察；照明光源采用光強可調(diào)的LED光源，通過放大倍率為Nikon10×的顯微物鏡進行聚焦照明；顯微鏡物鏡使用Nikon100×油浸平場消色差物鏡；載物臺通過標(biāo)稱分辨率為5 nm的Thorlabs電控高精密三維調(diào)整架進行微米級移動，整套實驗系統(tǒng)的光路簡圖如圖3所示. 由于觀察光路和激光光路共光路，故觀察焦點和光鑷作用的區(qū)間相同，正確對焦后微粒捕獲區(qū)域近似位于焦點附近，進行合適地調(diào)節(jié)后捕獲血紅細胞的成功率較高.

圖3 實驗裝置光路圖

2 結(jié)果與分析

2.1 單個細胞的捕獲與操控

通過三維調(diào)整架的x軸和y軸步進，移動樣品池，此時視野內(nèi)的所有細胞都隨樣品池移動. 打開激光光源，移動樣品池視野中央的雞血紅細胞立刻陷入光阱中被捕獲. 將雞血紅細胞移至視野中央，視野中單個細胞在光鑷作用下受力產(chǎn)生形變，繼續(xù)移動樣品池，視野中央細胞沒有隨著樣品池移動，穩(wěn)定在視野中央，說明細胞被捕獲. 繼續(xù)移動樣品池，可以觀察到其他細胞相對于被捕獲細胞有明顯的相對位移. 通過三維調(diào)整架移動載物平臺，可見中央被捕獲的細胞在光鑷的操縱下產(chǎn)生了明顯相對與其他細胞的位移(圖4).

(a) (b)

(c) (d)圖4 細胞操縱移動示意圖

利用圖像法進行距離標(biāo)定測量得出捕獲細胞與參考細胞A，B和C間的相對距離l(表1)，以便進一步驗證實驗現(xiàn)象.

表1 捕獲細胞與參考細胞距離數(shù)據(jù)

通過表1數(shù)據(jù)可以分析得出捕獲細胞與細胞A的相對距離逐漸增大，與細胞B的距離逐漸減小，與細胞C的距離先增大后減小. 因此，結(jié)合圖像和數(shù)據(jù)能夠得出該細胞在光鑷下被捕獲，并與沿圖像右上方進行操縱移動.

在光鑷系統(tǒng)中，橢球型的血紅細胞因為結(jié)構(gòu)的不對稱，在光力的作用下存在力矩效應(yīng)，可以導(dǎo)致細胞產(chǎn)生偏轉(zhuǎn)的形態(tài)變化，這種變化也可以作為細胞是否被捕獲的參考依據(jù).

2.2 多個細胞的捕獲與操縱

移動樣品池，使視野中央的捕獲光束通過比較密集的雞血紅細胞區(qū)域，發(fā)現(xiàn)光鑷有同時捕獲多個細胞的能力(圖5),實驗中可見單光束光鑷的捕獲能力較強，能夠在工作范圍內(nèi)同時捕獲多個細胞. 光鑷在工作范圍內(nèi)同時捕獲3個細胞，但同時捕獲的細胞存在上限，光鑷通過細胞集團時只能捕獲數(shù)個細胞，其他細胞雖有明顯受力現(xiàn)象，但未被光鑷捕獲，后續(xù)將在實驗中嚴格控制細胞濃度，減少鄰近細胞的影響.

圖5 捕獲多個細胞

3 討 論

對雞血紅細胞的大小測量采用了圖像法，需要先標(biāo)定實際圖像像素的大小. 首先隨機挑選了1個特定形狀作為觀測樣品，通過調(diào)整精密三維調(diào)整架移動樣品80 μm，圖上移動797.85個像素，即1像素約對應(yīng)0.10 μm. 標(biāo)定樣品尺寸如圖6所示.

(a)原觀測樣品圖

(b)移動后觀測樣品圖 圖6 標(biāo)定樣品尺寸圖

實驗所得圖像中，任選10個形狀完整外輪廓均勻的雞血紅細胞，由于雞血紅細胞橫截面近視為橢圓形，因此利用橢圓模型估算其大小(圖7).

圖7 血紅細胞大小測量實驗

通過測量1號紅細胞在圖像中長軸和短軸長度，得到血紅細胞的近似橢圓實際長軸a=13.0 μm，短軸b=8.4 μm. 同理可得，其余9個雞血紅細胞近似橢圓的實際長軸長和短軸長如表2所示. 采用取平均值的方法，將10次結(jié)果取的平均值作為雞血紅細胞大小的結(jié)果，故實驗中所捕獲的雞血紅細胞的截面大小約為(13.3±0.1) μm×(8.6±0.2) μm.

表2 血紅細胞尺寸表

4 結(jié)束語

利用新鮮雞血制備了雞血紅細胞的樣品懸液，在顯微系統(tǒng)中利用圖像法測量了樣品中雞血紅細胞的截面大小為(13.3±0.1) μm×(8.6 ± 0.2) μm，并利用光鑷技術(shù)實現(xiàn)了對單個和多個雞血紅細胞的穩(wěn)定捕獲.