王潔 王敏敏 陳瓊?

肺炎克雷伯菌是醫(yī)院感染的重要致病菌之一，主要引起泌尿系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)和手術(shù)部位感染及敗血癥［1］。隨著碳青霉烯類抗菌藥物的大量使用，臨床出現(xiàn)碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌，主要來自ICU，占74.36%［2］。感染碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌的病死率較碳青霉烯類敏感菌株明顯升高。高毒力肺炎克雷伯菌常引起多部位的感染和播散性膿腫及一些侵襲性感染，如肝膿腫、眼內(nèi)炎、腦膜炎、骨髓炎等［3］，并可繼發(fā)遷徙性播散而導(dǎo)致多器官感染，常伴有災(zāi)難性的后遺癥，且臨床致死率高［4］，可達3%～32%［5］。本文對一例急性重癥胰腺炎伴胰周膿腫和敗血癥的患者多部位分離到的肺炎克雷伯菌進行分析，探討其耐藥性、毒力基因與臨床的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 患者及菌株來源 患者，男，58歲，急性重癥胰腺炎，胰周膿腫伴敗血癥。對該患者多部位采樣，并進行細菌分離培養(yǎng)。采集標本包括血液，腹水，膿液，尿液。

1.2 儀器及試劑 儀器主要包括BRUKER公司的Ddtonik的質(zhì)譜儀，法國梅里埃的Vitek2-compact細菌鑒定儀和藥敏卡片，細菌孵育培養(yǎng)箱，生物安全柜，伯樂PCR儀，電泳凝膠成像系統(tǒng)，酒精燈，濁度儀，水解酪蛋白（MH）瓊脂，瓊脂糖（上海生工），PCR反應(yīng)相關(guān)試劑和酶（大連takara），英國Oxoid公司的藥敏紙片頭孢他定，美洛培南，頭孢哌酮舒巴坦。質(zhì)控菌株ATCC25922。

1.3 菌株鑒定與聚類分析 患者4份標本（血液、腹水、膿液和尿液標本）培養(yǎng)陽性菌株進行分離純培養(yǎng)，應(yīng)用MALDI-TOF對分離培養(yǎng)細菌進行菌種鑒定：消毒牙簽挑取少量單克隆菌落均勻涂布在質(zhì)譜點樣板上，加1μl質(zhì)譜基質(zhì)液，在室溫自然晾干，放入點樣靶板，進行全自動模式菌株鑒定。Score值≥2時，認為鑒定結(jié)果準確可信。同時，對4株菌株采用MALDI-TOF內(nèi)部軟件biotyper3.0 主成分分析系統(tǒng)（PCA）進行克隆分析，各種參數(shù)設(shè)置為系統(tǒng)默認。

1.4 藥敏試驗 患者4份標本分離的肺炎克雷伯菌在法國梅里埃的Vitek2-compact細菌鑒定藥敏儀進行藥敏試驗，抗菌藥物包括：頭孢曲松、亞胺培南、阿莫西林克拉維酸、哌拉西林他唑巴坦、頭孢西丁、頭孢吡肟、氨曲南、厄他培南、慶大霉素、阿米卡星、環(huán)丙沙星、左旋氧氟沙星、異帕米星、復(fù)方新諾明、呋喃妥因；應(yīng)用K-B法對頭孢他啶、美羅培南、頭孢哌酮／舒巴坦進行補充藥敏。

1.5 改良Hodge實驗 使用無菌生理鹽水將大腸埃希菌ATCC25922菌懸液調(diào)至0.5McF，并進行1：10稀釋，將菌液接種在MH瓊脂平板上，干燥3～10min，在平板中心貼美羅培南紙片，用1μl接種環(huán)挑取3～5個待測菌株并在平板上接種，接種時從平板中心紙片邊緣向平板邊緣劃線，長度至少20～25mm，（35±2）℃孵育16～20h，如在被測菌株與大腸埃希菌ATCC25922抑菌環(huán)交匯處大腸埃希菌生長增強，即產(chǎn)碳青霉烯酶。

1.6 拉絲試驗 用接種環(huán)挑取血平板上的待測菌株，緩慢上提接種環(huán)，觀察能否進行拉絲，拉絲長度＞5mm判定為待測菌株拉絲試驗陽性。

1.7 PCR擴增blaKPC耐藥基因和毒力基因檢測 應(yīng)用PCR對碳青霉烯酶blaKPC和肺炎克雷伯菌相關(guān)毒力基因進行檢測，檢測基因包括：K1、K2、rmpA、allS 、iut A、entB、iroN、uge、fimH、wabG 和 kf［6-8］。應(yīng)用天根生物技術(shù)公司的DNA抽提試劑盒，嚴格按照操作說明書進行全基因組提取備用。PCR反應(yīng)條件：10×PCR緩沖液，2.5mmol/L鎂離子，2mmol/L dNTPs，100μmol/L 引物，0.25U Taq 酶，1μlDNA 模板。95℃預(yù)變性5min；95℃變性1min，56℃退火復(fù)性30s，72℃延伸 40s；第二步至第四步進行30個循環(huán)。72℃延伸 10min。PCR 產(chǎn)物取 3μl進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，判斷有無毒力基因，同時進行Sanger測序驗證。

2 結(jié)果

2.1 藥物敏感性試驗 該患者不同部位共分離培養(yǎng)到4株肺炎克雷伯菌，對頭孢曲松、頭孢他啶、頭孢西丁、頭孢吡肟、阿莫西林/克拉維酸、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢哌酮/舒巴坦、氨曲南、慶大霉素、阿米卡星、環(huán)丙沙星、左旋氧氟沙星、異帕米星、復(fù)方新諾明、呋喃妥因均耐藥，對亞胺培南、厄他培南和美羅培南也均耐藥，只對替加環(huán)素敏感。

2.2 菌株特征 根據(jù)分離菌株的核糖體蛋白質(zhì)譜指紋圖譜，應(yīng)用biotyper 3.0 進行菌株聚類，聚類分析顯示，所分離菌株為相同克隆，且進化距離＜1.6（見圖1）。

2.3 分離肺炎克雷伯菌均表現(xiàn)為改良Hodge實驗陽性，均攜帶碳青霉烯類耐藥基因blaKPC。見圖2。

圖1 菌株進化距離分析圖

2.4 拉絲試驗 菌株拉絲試驗均為陽性，拉絲長度＞5mm。

2.5 毒力基因檢測 4株肺炎克雷伯菌毒力相關(guān)基因rmpA、allS 、iut A、entB、iroN、uge、fimH、wabG 和kfu均陽性，但莢膜抗原K1和K2基因均未檢出。

圖2 改良Hodge實驗結(jié)果

3 討論

3.1 高毒力肺炎克雷伯菌的研究現(xiàn)狀及臨床意義 肺炎克雷伯菌是臨床常見的病原菌，引起醫(yī)院內(nèi)的各種感染，產(chǎn)超廣譜β內(nèi)酰胺酶（ESBL）菌株的檢出率為20.7%～65.2%，產(chǎn)碳青霉烯酶（KPC）的菌株也在逐年增加［9］，臨床治療困難。研究認為，大部分高毒力的肺炎克雷伯菌只對氨芐類抗生素產(chǎn)生耐藥，對常用的抗菌藥物依舊敏感［10］，可能與高毒力肺炎克雷伯菌感染多為社區(qū)獲得性有關(guān)，但由于大量廣譜抗生素的使用，出現(xiàn)越來越多的耐藥菌株。多耐藥的高毒力肺炎克雷伯菌在中國臺灣僅有個案報道［11］。目前，已確定了78個莢膜血清型的肺炎克雷伯菌。本資料中患者急性重癥胰腺炎伴胰周膿腫和敗血癥，病情危重。從該患者多部位（血液、腹水、膿液和尿液）分離的肺炎克雷伯菌拉絲試驗陽性，且攜帶多個毒力基因，可能為高毒力肺炎克雷伯菌。

3.2 毒力因子與致病性的相關(guān)性 莢膜多糖是肺炎克雷伯菌的重要抗原成分和毒力因子，可用于對抗中性粒細胞吞噬，目前研究報道較多的是K抗原。本資料肺炎克雷伯菌莢膜抗原PCR檢測顯示，所分離的致多處感染的4株肺炎克雷伯菌株均未攜帶K1和K2抗原，表明該類肺炎克雷伯菌為非K1/K2型菌株，鑒于該肺炎克雷伯菌拉絲試驗陽性，表明4株肺炎克雷伯菌均為高黏液型細菌，而高黏液型細菌一般含有較為豐富的莢膜多糖，因此，作者推測，4株細菌可能攜帶其他亞型的K 抗原［12］。肺炎克雷伯菌除K1和K2抗原陰性外，其他毒力相關(guān)基因（rmpA、allS 、iut A、entB、iroN、uge、fimH、wabG和kfu）均為陽性，表明4株細菌攜帶多種毒力因子［13］。rmpA基因是調(diào)控形成黏液性菌落的胞外多糖合成過程的重要調(diào)控因子，但肺炎克雷伯菌在合成胞外多糖過程中，rmpA不是獨立發(fā)揮作用，而是與其他一些因子共同發(fā)揮調(diào)控作用，其中IutA（需氧素-鐵離子復(fù)合體受體）是其重要組成部分；wabG因子則編碼莢膜多糖中巖藻糖的生物合成，可增強菌體抗巨噬細胞吞噬作用；entB是腸毒素基因；uge基因存在于所有的肺炎克雷伯氏菌中，與LPS合成密切相關(guān)；iroN基因可使細菌競爭組織中的鐵以增強生存能力；allS基因可保證肺炎克雷伯菌在有氧和無氧條件下均可以利用尿素囊碳源、氮源、能量來源； kfu基因增強高毒力肺炎克雷伯菌的毒力，fimH是組成肺炎克雷伯菌小分子粘附素的重要組成成分，在細菌粘附宿主細胞過程中發(fā)揮重要作用。本資料所分離的4株肺炎克雷伯菌既攜帶胞外多糖合成成分、莢膜多糖合成成分和粘附素等，又攜帶腸毒素基因和LPS基因等，可以表達自我保護成分、增加粘附侵襲力及毒素等多種毒力因子，是一株高毒力肺炎克雷伯菌，因此可以導(dǎo)致患者多處感染。

3.3 耐藥性分析與規(guī)范合理利用抗生素的必要性 本資料結(jié)果顯示分離菌株對頭孢曲松、頭孢他啶、頭孢西丁、頭孢吡肟、阿莫西林/克拉維酸、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢哌酮/舒巴坦、氨曲南、慶大霉素、阿米卡星、環(huán)丙沙星、左旋氧氟沙星、異帕米星、復(fù)方新諾明、呋喃妥因、亞胺培南、厄他培南和美羅培南均耐藥，只對替加環(huán)素敏感，均為碳青霉烯類耐藥菌株，碳青霉烯酶blaKPC是其主要耐藥機制，表明在這幾株分離自ICU同一患者的高毒力肺炎克雷伯菌已經(jīng)產(chǎn)生嚴重的耐藥性。