曹巖菁 吳佳麗? 李鵬 馮莉 王琴 任謙

血管性癡呆（VD）［1］是多種腦血管因素導(dǎo)致，主要以記憶、認(rèn)知功能損害，同時(shí)伴有語言、運(yùn)動(dòng)、人格等多方面障礙的綜合征。目前，關(guān)于血管性癡呆的治療仍是亟需解決的難題。多年來，國內(nèi)外研究人員發(fā)現(xiàn)，中藥黃芩莖葉黃酮（SSTF）不僅能對(duì)老年性記憶缺陷有明顯的改善作用［2］，且對(duì)血管性記憶障礙的改善也有同效，然而其具體作用機(jī)制尚不明確。2015年6月至2016年1月作者通過實(shí)驗(yàn)研究，探討不同劑量SSTF對(duì)VD大鼠模型的行為學(xué)及其對(duì)p-tau、PP2A、GSK3β蛋白表達(dá)的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑和材料 SD 大鼠（清潔級(jí)）；水合氯醛（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；0.9%氯化鈉注射液（浙江莎普愛思藥業(yè)股份有限公司）；注射用青霉素鈉（江西省科達(dá)動(dòng)物藥業(yè)有限公司）；碘伏（德州欣瑞達(dá)消毒制品有限公司）。SSTF提取物購自河北承德醫(yī)學(xué)院藥理研究室（Lot No. 010608）。藥物純度≥62%。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 SD大鼠60只（19month，平均230～270g，雌、雄各半）。排除有游泳障礙的大鼠。隨機(jī)將大鼠分成正常組、假手術(shù)組及模型組（SSTF-50：術(shù)后8d予50mg/kg的SSTF喂養(yǎng)至68d。SSTF-100：術(shù)后8d給予100mg/kg SSTF喂養(yǎng)至68d）。BCCAO法造模。假手術(shù)組步驟同上，僅分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈不阻斷血流，術(shù)后8d給予0.9%生理鹽水至68d［10ml/（kg·d）腹腔注射］。正常組不做任何處理，給予0.9%生理鹽水至 68d［10ml/（kg·d）］。去除死亡大鼠。

1.3 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 采取Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)對(duì)大鼠進(jìn)行行為和認(rèn)知功能測(cè)試。記錄正常組、模型組及藥物干預(yù)組四組在術(shù)后63～68d Morris 迷宮實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。通過軟件追蹤記錄分析，評(píng)價(jià)大鼠的記憶能力及腦缺血損傷模型對(duì)記憶的印象等。癡呆標(biāo)準(zhǔn)：對(duì)照組大鼠模型逃避時(shí)間的均值為參考值，計(jì)算實(shí)驗(yàn)各組大鼠各時(shí)段平均逃避潛伏期與參考值之間差值占該大鼠的平均逃避潛伏期的比值，如＞20%定為模型成功。

1.4 Western blotting檢測(cè) 術(shù)后12周，選取每組9只進(jìn)行斷頭取腦，4%甲醛固定，行免疫組化檢測(cè)。將大鼠斷頭取腦，冰上分離大腦皮層和海馬，液氮速凍，于-80℃保存，行Western blotting檢測(cè)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（），用t檢驗(yàn)。水迷宮實(shí)驗(yàn)中逃避潛伏期及游行距離間的差異使用two-way ANOVA分析和post-hoc檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組VD大鼠認(rèn)知功能障礙比較 見圖1。

圖1 各組大鼠認(rèn)知功能障礙

2.2 各組大鼠tau蛋白磷酸化的水平比較 見圖2。

圖2 各組大鼠tau蛋白磷酸化水平比較

2.3 SSTF對(duì)GSK3β蛋白表達(dá)活性的影響 見圖3。

2.4 各組大鼠Cdk5、p35、p25蛋白的表達(dá)比較 見圖4。

2.5 各組大鼠PP2A蛋白表達(dá)比較 見圖5。

圖3 各組大鼠GSK3βSer9蛋白的表達(dá)比較

圖4 各組大鼠Cdk5、p35、p25蛋白表達(dá)比較

圖5 各組大鼠PP2A蛋白表達(dá)比較

3 討論

本研究以BCCAO動(dòng)物模型為基礎(chǔ)，觀察了動(dòng)脈栓塞后大鼠腦組織廣泛慢性缺血狀態(tài)下的動(dòng)物行為學(xué)的特點(diǎn)。結(jié)果顯示，在水迷宮試驗(yàn)的訓(xùn)練階段，隨著訓(xùn)練次數(shù)的增加，與正常對(duì)照組大鼠相比，癡呆組大鼠的逃避潛伏期明顯延長；探索試驗(yàn)中，癡呆組大鼠穿越平臺(tái)的次數(shù)明顯減少。同樣，與正常組比較，癡呆組大鼠在象限中游行距離的百分比也明顯縮短。表明在慢性缺血60d后，大鼠表現(xiàn)為明顯的學(xué)習(xí)及空間能力的障礙。給予SSTF提取物100mg/kg干預(yù)治療后，能夠明顯縮短癡呆組大鼠逃避潛伏期的時(shí)間，增加大鼠穿越平臺(tái)的次數(shù)，延長大鼠在象限中游行的距離，最終達(dá)到改善大鼠認(rèn)知功能障礙的目的，表明100mg/kg是SSTF提取物能夠產(chǎn)生效用的最小劑量。

本資料顯示，隨著缺血時(shí)間的不斷延長，磷酸化的tau蛋白在大鼠額葉皮層及海馬中表達(dá)明顯增加。而當(dāng)給予100mg/kg的SSTF干預(yù)治療后，癡呆組大鼠腦額葉皮層及海馬磷酸化tau蛋白的水平明顯下降。以往研究表明，Tau蛋白過度磷酸化是癡呆及記憶障礙發(fā)生的主要病理機(jī)制之一，過度磷酸化的tau蛋白有助于Aβ和神經(jīng)纖維纏結(jié)的形成［3］，而后者又加重了缺血性卒中后的神經(jīng)損傷和細(xì)胞凋亡。鑒于磷酸化tau蛋白與疾病的進(jìn)展關(guān)系密切，SSTF是否能夠通過降低tau蛋白的過度磷酸化水平，而改善癡呆大鼠的認(rèn)知功能障礙的機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究。

眾所周知，一些酶的家族，尤其是激酶，在tau蛋白磷酸化過程中扮演重要角色。雖然，GSK3β（S199、T231、S396、S413） 和 Cdk5（S202、T205、S235、S404）具有相似的磷酸化激活位點(diǎn)［4］，然而二者的作用機(jī)制卻有較大的區(qū)別。Cdk5蛋白的基礎(chǔ)活性較低，需要激活物才能激活，除此之外，Cdk5位于胞漿內(nèi)，而其生理激活物P35蛋白卻是膜相關(guān)蛋白。只有在P35鈣蛋白酶水解生成P25釋放至胞漿時(shí)，才能進(jìn)一步激活Cdk5蛋白［5］。這提示GSK3β與Cdk5對(duì)tau蛋白磷酸化的作用機(jī)制不同。本資料顯示，當(dāng)給予100mg/kg的SSTF干預(yù)治療后，GSK3β和Cdk5蛋白的表達(dá)在正常組，假手術(shù)組及藥物干預(yù)組四者間無明顯差異，表明SSTF黃酮提取物不能影響癡呆大鼠腦GSK3β和Cdk5蛋白的表達(dá)。然而，對(duì)于磷酸化的糖原合成酶激酶-3β（p-GSK3β），其水平在血管癡呆性大鼠腦額葉皮層及海馬中表達(dá)明顯下降，表明在慢性缺血致腦損傷后，GSK3β在缺血大鼠大腦皮層及海馬內(nèi)的表達(dá)呈動(dòng)態(tài)變化，下降的p-GSK3β可能參與慢性全腦缺血狀態(tài)下的大鼠認(rèn)知功能障礙的發(fā)生。進(jìn)一步，SSTF提取物100mg/kg干預(yù)治療后，血管癡呆組大鼠大腦皮層和海馬內(nèi)p-GSK3蛋白的表達(dá)明顯增高。而p35的表達(dá)，本資料結(jié)果表明，癡呆組大鼠腦皮層及海馬內(nèi)的p35蛋白表達(dá)明顯增高，p25蛋白在血管性癡呆大鼠腦內(nèi)表達(dá)明顯增高，100mg/kgSSTF提取物后，能夠明顯降低p35，p25蛋白的表達(dá)水平。表明SSTF提取物參與了對(duì)GSK3β和Cdk5蛋白活性的調(diào)節(jié)，從而導(dǎo)致了tau蛋白在不同位點(diǎn)的磷酸化水平的降低。

PP2A是一種廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)的，絲氨酸／蘇氨酸磷酸酯酶中極為重要的一種蛋白磷酸酯酶，在細(xì)胞功能的諸多方面均起著相當(dāng)重要的作用，直接或間接參與了細(xì)胞的新陳代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、DNA復(fù)制、蛋白合成、生長發(fā)育及凋亡等活動(dòng)方式。本資料顯示，慢性腦缺血致認(rèn)知功能障礙大鼠的腦皮層及海馬中，PP2A-sub B蛋白的表達(dá)明顯下降，表明PP2A參與了缺血狀態(tài)下的大鼠認(rèn)知功能障礙的發(fā)生。而這些變化似乎均與tau蛋白有關(guān)，tau蛋白是PP2A作用的底物，當(dāng)PP2A活性降低時(shí)能夠抑制tau蛋白的去磷酸化，而tau蛋白在過度磷酸化后會(huì)形成NFT，進(jìn)一步影響大腦的認(rèn)知功能［6］。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)tau蛋白過度磷酸化可能與GSK3β，PP2A的表達(dá)失衡有關(guān)。而給予一定濃度和劑量的SSTF后，顯著改善GSK3β和PP2A間的平衡，從而降低缺血大鼠大腦皮層及海馬內(nèi)磷酸化tau蛋白的水平，繼而改善大鼠的記憶功能。