張治平 倪松 林筍美

糖尿病是由胰島素分泌不足或功能異常而導(dǎo)致的一組以持續(xù)性高血糖為病理特征的代謝性疾病，常累及心血管系統(tǒng)，誘發(fā)糖尿病性心肌病，是獨(dú)立于心臟自主神經(jīng)病變之外的心臟結(jié)構(gòu)和功能異常［1］。少數(shù)患者可能發(fā)生糖尿病心肌病性心力衰竭（DCM-HF），發(fā)病程度重，病死率高［2］。尋找兼有改善心肌功能和降血糖效果的藥物是降低DCM-HF發(fā)生率，改善DCMHF治療效果的重要方向，在此導(dǎo)向下，5-羥色胺受體4（HTR4）受到越來越多的重視［3］。作為HTR4激動(dòng)劑，莫沙比利可能同時(shí)具有心肌保護(hù)和降糖功能，2016年1月至12月作者通過實(shí)驗(yàn)研究，建立DCM-HF大鼠模型，觀察莫沙比利作用的效果。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為100只SPF級(jí)雄性SD大鼠，7～8個(gè)月齡，體重（180±20）g，購自浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品 枸櫞酸莫沙比利片，生產(chǎn)企業(yè)：江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字：H19990315。

1.3 主要儀器與試劑 生物顯微鏡（日本Olympus，CX23）；小 動(dòng) 物 超 聲 儀（ 加 拿 大 Visual Sonics，VEVO）；智能型高效離心機(jī)（德國Beckman Coulter，Avanti JXN-30/26）；血糖儀（瑞士ROCHE，ACCUCHEK）；小型垂直電泳和電轉(zhuǎn)印裝置（美國BIORAD，Mini- PROTEAN3）；鏈脲佐菌素（Sigma官網(wǎng)，S0130）；DAB 顯色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，DA1010）；BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒（碧云天，P0009）；多克隆兔抗HTR4抗體（ab60359）、多克隆兔抗LATS2抗體（ab110780）、單克隆兔抗YAP1抗體（ab52771）、山羊抗兔IgG抗體（ab150077）均購自Abcam官網(wǎng)。

1.4 模型制備與評(píng)價(jià)方法 模型組、高劑量組、中劑量組、低劑量組均采用高脂飲食和腹腔注射鏈脲佐菌素的方法制備DCM-HF模型，主要步驟：予以高脂飲食，配方：50%普通飼料+28%豬油+2%蛋黃+20%糖，飼養(yǎng)期間每隔4周尾靜脈取血測(cè)定糖耐量和胰島素耐量，產(chǎn)生胰島素抵抗者予以鏈脲佐菌素，多數(shù)大鼠產(chǎn)生胰島素抵抗時(shí)間為8～12周。腹腔注射鏈脲佐菌素，用量35mg/kg，注射后繼續(xù)高脂飲食飼養(yǎng)，每隔1周尾靜脈取血測(cè)定血糖，連續(xù)2次測(cè)定值≥11.1mmol/L為糖尿病模型制備成功。所有成功的糖尿病模型繼續(xù)高脂飲食飼養(yǎng)8周，高劑量組、中劑量組和低劑量組分別予以莫沙比利4mg/kg、2mg/kg、1mg/mg，溶于無菌蒸餾水，灌胃給藥。8周后采用超聲心動(dòng)圖測(cè)定大鼠心功能，主要指標(biāo)：左室舒張末期容積（LVEDV）、左室舒張末期內(nèi)徑（LVEDD）、左室收縮末期容積（LVESV）、左室收縮末期內(nèi)徑（LVESD）。左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）=（LVEDV- LVESV）/LVEDV×100%；左 室 縮 短 分 數(shù)（LVFS）=（LVEDD-LVESD）/LVEDD×100%。LVEF和LVFS均較正常值下降＞30%為DCM-HF模型成功。

1.5 心肌組織病理觀察方法 各組隨機(jī)選取6只，進(jìn)行多聚甲醛心臟灌注，灌注的目的在于排出循環(huán)系統(tǒng)血液，并固定心臟組織，灌注至全身僵硬時(shí)，可取完整心臟組織，制備石蠟病理切片，厚度3～5μm。二甲苯脫蠟，連續(xù)2次，梯度酒精脫水，45%、60%、75%、85%、95%、無水乙醇分別浸泡5min。蘇木素染色，鹽酸酒精分化，伊紅復(fù)染，再次經(jīng)梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，生物顯微鏡下觀察心肌組織病理形態(tài)。

1.6 心肌組織蛋白表達(dá)水平測(cè)定方法 各組剩余大鼠不行心臟灌注，直接斷頭處死，取心肌病理組織，液氮保存，用于免疫蛋白印記（WB）實(shí)驗(yàn)。主要步驟：采用蛋白質(zhì)抽提試劑盒提取心肌組織的蛋白質(zhì)，并溶解于Buffer液，備用。BCA法測(cè)定樣品蛋白質(zhì)濃度，以10μg/電泳通道的上樣量進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，將不同分子量的蛋白條帶分開，并常規(guī)電轉(zhuǎn)印至NC膜。5%的脫脂牛奶封閉1h，封閉的作用在于消除非特異性蛋白結(jié)合條帶對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。一抗孵育，HTR4、LATS2、YAP1抗體濃度分別為1∶1500、1∶2000和1∶1500，4℃過夜；二抗孵育，三種蛋白的二抗一致，濃度均為1∶2000，37℃孵育90min。ECL顯影和暗室顯像后保留膠片，Image J軟件分析灰度值，目的產(chǎn)物蛋白表達(dá)量=目的條帶灰度/內(nèi)參條帶灰度。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。正態(tài)分布計(jì)量資料以（）表示，三組間比較用方差分析，兩組間比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 模型制備結(jié)果 本實(shí)驗(yàn)無大鼠死亡，模型組、高劑量組、中劑量組、低劑量組模型制備成功率分別為60%（12只）、75%（15只）、65%（13只）、65%（13只），整體成模率為66.3%。

2.2 各組大鼠心肌功能比較 見表1。

表1 各組大鼠心肌功能比較［%，（）］

表1 各組大鼠心肌功能比較［%，（）］

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與低劑量組比較，ΔP＜0.05；與中劑量比較，▲P＜0.05

組別 n LVEF LVFS模型組 12 65.5±7.3* 37.8±5.1 *低劑量組 15 72.4±8.2 *# 44.3±5.5 *#中劑量組 13 79.3±9.2 *#Δ 51.7±6.4 *#Δ高劑量組 13 84.6±9.4 *#Δ▲ 57.2±7.2 *#Δ▲對(duì)照組 20 94.3±10.6 71.3±9.1

2.3 各組大鼠心肌組織病理觀察 對(duì)照組大鼠心肌細(xì)胞排列整齊，連接緊密，有明顯的肌纖維結(jié)構(gòu)，肌束間分割線明顯；模型組細(xì)胞核出現(xiàn)溶解，肌絲、肌節(jié)、肌纖維結(jié)構(gòu)消失，胞漿內(nèi)可見較大的增厚性條帶；低劑量組、中劑量組和高劑量組的變化介于對(duì)照組和模型組之間，病變程度較模型組輕。見圖1。

圖1 各組大鼠典型心肌組織HE染色

2.4 各組大鼠心肌組織HTR4、LATS2、YAP1表達(dá)水平比較 見表2、圖2。

表2 各組大鼠心肌組織HTR4、LATS2、YAP1表達(dá)水平比較

圖2 各組大鼠心肌組織HTR4、LATS2、YAP1的WB實(shí)驗(yàn)灰度圖

3 討論

HTR4激動(dòng)劑莫沙比利能提高II型糖尿病患者的血胰島素水平和胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）水平，具有降糖作用，被認(rèn)為是一種潛在的抗II型糖尿病藥物。另有研究表明［4］，激活HTR4能夠增加胰島素受體酪氨酸殘基磷酸化，提高胰島素受體的敏感性，緩解糖尿病性胃輕癱。進(jìn)一步研究表明［5］，HTR4特異性的分布于肌肉組織，因此高表達(dá)于心肌組織、胃腸肌群和骨骼肌。HTR4在心力衰竭的治療中仍受爭(zhēng)議，其拮抗劑和激動(dòng)劑均可能有治療心力衰竭的作用。一方面，早期的研究表明5-羥色胺（5-HT）與受體HTR4結(jié)合可發(fā)揮正性肌力作用，促進(jìn)心肌的收縮功能；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物性研究也證實(shí)心肌中HTR4水平在發(fā)生充血性心力衰竭時(shí)可提高數(shù)倍，同時(shí)與心肌收縮性呈正比，提示HTR4在心力衰竭心肌中的表達(dá)可能是一種保護(hù)性機(jī)制［6］。另一方面，有研究指出HTR4拮抗劑能顯著提高心臟左室舒張功能，改善左室射血分?jǐn)?shù)，但對(duì)其他指標(biāo)卻無改善［7］。產(chǎn)生這些爭(zhēng)議的原因可能與疾病類型和藥物使用時(shí)間有關(guān)，DCM-HF的病理結(jié)構(gòu)不同于充血性心力衰竭，HTR4在DCM-HF中具體發(fā)揮什么作用還需要相加詳實(shí)的數(shù)據(jù)支持。有學(xué)者利用基因芯片技術(shù)證實(shí)在糖尿病心肌病心肌組織HTR4水平表現(xiàn)出先升高后下降的趨勢(shì)，伴隨著心臟出現(xiàn)收縮功能下降，進(jìn)而收縮和舒張功能均下降。以上研究提示HTR4及其激動(dòng)劑可能兼有降血糖作用和改善心力衰竭作用。

Hippo信號(hào)通路是一條細(xì)胞生長抑制性信號(hào)通路，能夠控制器官的生長、發(fā)育和損傷后修復(fù)，對(duì)心肌發(fā)育與修復(fù)、心血管發(fā)育與修復(fù)均有重要作用［8］。在Hippo信號(hào)通路中，LATS是最主要的核心激酶之一，高表達(dá)于心肌和骨骼肌組織，其定位與HTR4基本一致。進(jìn)一步研究表明控制Hippo通路的G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）能被HTR4激活，表明Hippo通路可能參與HTR4對(duì)心血管和骨骼肌系統(tǒng)的功能調(diào)控［9］。

本資料結(jié)果顯示，DCM-HF大鼠的心肌功能明顯低于健康大鼠，經(jīng)莫沙比利干預(yù)后其心肌功能有明顯提高，且提高程度與干預(yù)劑量有一定的相關(guān)性。同時(shí)DCM-HF大鼠的HTR4和LATS2表達(dá)水平明顯降低，YAP1表達(dá)水平升高，經(jīng)莫沙比利干預(yù)后HTR4和LATS2表達(dá)水平得以升高，YAP1表達(dá)水平得以降低，且其改變幅度與劑量密切相關(guān)。LATS2是Hippo通路的核心成員，過表達(dá)LATS2的轉(zhuǎn)基因小鼠心臟發(fā)育受到阻礙，出現(xiàn)體積減小、重量減輕或功能不全［10］；敲除LATS2的小鼠由于中胚層過度增殖，也會(huì)出現(xiàn)心臟發(fā)育異常，過度增厚，心室結(jié)構(gòu)不良［11］。YAP1是Hippo通路的主要下游效應(yīng)蛋白，LATS2能夠磷酸化YAP1的127位點(diǎn)，使其無法進(jìn)入細(xì)胞核傳遞信號(hào)，停留在細(xì)胞質(zhì)而失活，因此Hippo通路主要通過抑制YAP1活性而調(diào)控其下游生理功能，通過該途徑，Hippo通路對(duì)Wnt、胰島素樣生長因子（IGF）信號(hào)等均可達(dá)到調(diào)控作用［12］。敲除YAP1與過表達(dá)LATS2可發(fā)揮相仿的作用，表現(xiàn)為小鼠胚胎發(fā)育障礙，器官發(fā)育不全而死亡。在小鼠出生以后誘導(dǎo)心肌細(xì)胞過表達(dá)YAP1還可以增加心肌細(xì)胞數(shù)量和心臟總重量。可見，Hippo通路對(duì)心臟有雙重作用，激活Hippo通路對(duì)心臟修復(fù)是否有利取決于疾病的具體病理變化。本研究結(jié)果顯示HTR4激動(dòng)劑莫沙比利對(duì)DCM-HF大鼠的心肌功能具有改善作用，且該作用與激活Hippo通路有關(guān)。