余 洋，林立紅*，李曉磊，李 娜，鄭鴻薇，羅雪琪

(1.沈陽(yáng)化工研究院有限公司 安全評(píng)價(jià)中心，遼寧 沈陽(yáng) 110141；2.沈陽(yáng)化工大學(xué) 應(yīng)用化學(xué)學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110020)

我國(guó)是農(nóng)業(yè)大國(guó)，農(nóng)藥在農(nóng)業(yè)發(fā)展中占有重要地位[1]。其中除草劑在農(nóng)藥使用中占比很大，我國(guó)除草劑的使用呈現(xiàn)與日俱增的趨勢(shì)，增速達(dá)每年200萬(wàn)hm2[2]。農(nóng)藥的使用情況與人體健康息息相關(guān)，化學(xué)除草劑的大量使用對(duì)人體健康會(huì)產(chǎn)生一定危害，所以除草劑的安全問(wèn)題日益受到研究者的重視[3]。對(duì)于農(nóng)藥安全問(wèn)題的研究主要包括其在作物上的殘留、對(duì)環(huán)境的影響以及對(duì)哺乳動(dòng)物的毒性[4-8]方面。氟噻草胺是拜耳公司研發(fā)的一種新型芳氧酰胺類(lèi)除草劑，主要用于玉米、谷類(lèi)、棉花、花生、土豆、大米、大豆、向日葵、西紅柿等作物，防除眾多一年生禾本科雜草(如多花黑麥草等)和部分闊葉雜草[9]。目前對(duì)氟噻草胺的研究多集中于其與其他除草劑的合用[10-11]，以及在環(huán)境、谷物等中的殘留與毒性檢測(cè)[12-14]，而關(guān)于其在動(dòng)物體內(nèi)的研究相對(duì)較少，尚未見(jiàn)其大鼠排泄研究的相關(guān)報(bào)道。體內(nèi)研究對(duì)于農(nóng)藥研發(fā)、毒理作用機(jī)制、毒物的安全性評(píng)價(jià)以及中毒解救有重要意義。因此本文建立了快速、高效的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)法對(duì)氟噻草胺在大鼠體內(nèi)的排泄情況進(jìn)行研究。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

島津LC-20A/API3200液質(zhì)聯(lián)用儀，配備Analyst 1.5.1操作軟件；Sartorius BSA3233S電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司)；Milli-Q超純水機(jī)(美國(guó)Millipore公司)；KQ5200B型超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；SIGMA 3K15高速離心機(jī)(美國(guó)Sigma公司)；QT-1渦旋振蕩器(上海琪特分析儀器有限公司)；T18 basic新型高速分散機(jī)(德國(guó)IKA公司)；移液器(德國(guó)Eppendorf公司)。

氟噻草胺(沈陽(yáng)化工研究院新藥所)；啶氧菌酯(內(nèi)標(biāo)，沈陽(yáng)化工研究院農(nóng)標(biāo)室)；乙腈(色譜純，美國(guó)Fisher Scientific公司)；甲酸(色譜純，阿拉丁試劑有限公司)；玉米油(中糧食品營(yíng)銷(xiāo)有限公司)；超純水(自制)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性SD大鼠，由遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK(遼) 2015-0001。動(dòng)物室溫度19～26 ℃，濕度：40%～70%，照明：150～300 Lux(明暗各12 h)，噪音在60 dB以下。動(dòng)物的使用經(jīng)本中心倫理委員會(huì)審批通過(guò)。實(shí)驗(yàn)前所有SD大鼠以動(dòng)物飼料為全價(jià)顆粒飼料飼養(yǎng)于塑料動(dòng)物盒內(nèi)，自由進(jìn)食飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d。之后將每只大鼠分別飼養(yǎng)于一個(gè)不銹鋼籠內(nèi)，給藥前禁食約18 h，均采用灌胃方式染毒，染毒容積10 mL/kg。

1.3 色譜-質(zhì)譜條件

色譜條件：Phenomenex反向C18色譜柱(50 mm×4.6 mm，5 μm)；流速0.6 mL/min；柱溫：室溫；進(jìn)樣體積：10 μL；流動(dòng)相：0.1%甲酸水-乙腈(28∶72)；等度洗脫。

質(zhì)譜條件：離子源：ESI源；離子源溫度：450 ℃；噴霧電壓：5 000 V；碰撞氣:20 685 Pa;去簇電壓:28.00 V;射入電壓:5.20 V;碰撞室入口電壓:20.73 V;碰撞室出口電壓:11.00 V;GAS1:344 750 Pa;GAS2:379 225 Pa;氣簾氣：172 375 Pa；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)；氟噻草胺與內(nèi)標(biāo)(啶氧菌酯)的定量離子對(duì)分別為m/z364.1/194.2和m/z368.1/145.2；碰撞能量分別為14.00 eV和26.00 eV。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：精密稱(chēng)取氟噻草胺適量，加乙腈溶解并定容至100 mL，得質(zhì)量濃度為1 g/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，于-20 ℃下貯存。

標(biāo)準(zhǔn)工作溶液(用于尿液)：精密量取適量?jī)?chǔ)備液，用乙腈稀釋為0.50、1.00、2.00、5.00、12.5、25.0、50.0 mg/L的氟噻草胺系列標(biāo)準(zhǔn)溶液;質(zhì)控(QC)工作溶液：1.25 mg/L(低濃度質(zhì)控，LQC)、5.00 mg/L(中濃度質(zhì)控，MQC)、40.0 mg/L(高濃度質(zhì)控，HQC)。

標(biāo)準(zhǔn)工作溶液(用于糞便)：精密量取適量?jī)?chǔ)備液，用乙腈稀釋為1.25、2.50、6.25、20.0、50.0、125、250 mg/L的氟噻草胺系列標(biāo)準(zhǔn)溶液;QC工作溶液：3.75 mg/L(LQC)、25.0 mg/L(MQC)、200 mg/L(HQC)。

內(nèi)標(biāo)溶液：精密稱(chēng)取啶氧菌酯適量于100 mL容量瓶中，用乙腈溶解并稀釋至刻度，得到質(zhì)量濃度為1 g/L的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液。精密量取該儲(chǔ)備液，用乙腈分別稀釋成2.50 mg/L(用于尿液)和20.0 mg/L(用于糞便)的內(nèi)標(biāo)工作溶液。

1.5 樣品采集

取大鼠6只，給藥組5只(400 mg/kg)，空白溶液對(duì)照組1只。給藥前禁食18 h，以經(jīng)口灌胃法一次給足設(shè)計(jì)劑量，給藥容積為0.1 mL/kg體重，給藥后將大鼠放回飼養(yǎng)籠內(nèi)，自由進(jìn)食、飲水。收集大鼠0～7 h、7～24 h、24～48 h、48～72 h、72～96 h、96～144 h的尿樣和糞樣，各時(shí)間段的尿樣合并后記錄總體積，混合均勻，置于凍存管內(nèi)；各時(shí)間段的糞樣收集后合并稱(chēng)重，裝入廣口塑料瓶中，-20 ℃冷凍待測(cè)。末次收集樣品后采用乙腈清洗糞尿收集管，記錄總體積，置于凍存管內(nèi)，-20 ℃冷凍待測(cè)。

1.6 樣品處理

空白糞樣提取液：取大鼠空白糞樣適量，加入5倍量的乙腈溶液，勻漿均勻，4 ℃下以15 000 r/min離心10 min，取上清液即得。

糞便樣品前處理：將糞樣室溫解凍，加入5倍量的乙腈溶液，勻漿均勻，4 ℃下以15 000 r/min離心10 min，取上清液100 μL，加入20 μL 內(nèi)標(biāo)，渦旋混勻后，取液體適量用80%乙腈溶液稀釋100倍，進(jìn)行儀器分析。

尿液樣品：將樣品室溫解凍混勻，取尿液100 μL，加入20 μL 內(nèi)標(biāo)，渦旋混勻，再加入乙腈200 μL混勻，4 ℃下以15 000 r/min離心10 min，取上清液適量，用70%乙腈溶液稀釋50倍，進(jìn)行儀器分析。

糞尿清洗液：將糞尿清洗液室溫解凍，混勻，取100 μL，加入20 μL內(nèi)標(biāo)，渦旋混勻，再加入乙腈200 μL混勻，4 ℃下以15 000 r/min離心10 min，取上清液適量，用70%乙腈溶液稀釋50倍，進(jìn)行儀器分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件優(yōu)化

分別考察了甲醇和乙腈作為有機(jī)相，超純水和乙酸銨作為水相時(shí)對(duì)氟噻草胺響應(yīng)值的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以乙腈-超純水為流動(dòng)相時(shí)，氟噻草胺的響應(yīng)較好，且在水相中添加0.1%甲酸，可增加ESI+模式下的離子化效率。

流動(dòng)相中有機(jī)相與水相的不同配比對(duì)待測(cè)物的保留時(shí)間與響應(yīng)有很大影響。實(shí)驗(yàn)考察了乙腈-0.1%甲酸水(85∶15)、乙腈-0.1%甲酸水(80∶20)、乙腈-0.1%甲酸水(70∶30)作為流動(dòng)相時(shí)的分離效果，發(fā)現(xiàn)乙腈-0.1%甲酸水(70∶30)作為流動(dòng)相時(shí)出峰時(shí)間合適。進(jìn)一步優(yōu)化發(fā)現(xiàn)以乙腈-0.1%甲酸(72∶28)作為流動(dòng)相可縮短分析時(shí)間，且內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)待測(cè)物及內(nèi)標(biāo)的測(cè)定無(wú)干擾。在“1.3”色譜條件下，尿液中氟噻草胺及內(nèi)標(biāo)的典型色譜圖見(jiàn)圖1。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線與定量下限用空白尿液與空白糞便提取液將對(duì)應(yīng)工作溶液稀釋成一系列質(zhì)量濃度為0.10、0.20、0.40、1.00、2.50、5.00、10.0 mg/L(尿液)；0.25、0.50、1.25、4.00、10.0、25.0、50.0 mg/L(糞便)的氟噻草胺標(biāo)準(zhǔn)溶液樣品，按照“1.3”條件進(jìn)行分析，以質(zhì)量濃度(X,mg/L)為橫坐標(biāo)，待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值(Y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，氟噻草胺在0.10～10.0 mg/L(尿液)及0.25～50.0 mg/L(糞便)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)分別為0.999 0和0.995 8。

在空白尿液與糞便樣品中添加氟噻草胺對(duì)照品，以信噪比S/N≥10計(jì)算方法的定量下限(LOQ)。結(jié)果表明，氟噻草胺在大鼠尿液與糞便中的LOQ分別為0.10、0.25 mg/L。

2.2.2準(zhǔn)確度與精密度以空白尿液、糞便提取液為基質(zhì)將質(zhì)控樣品工作溶液稀釋成低、中、高(尿液：0.25、1.00、8.00 mg/L;糞便：0.75、5.00、40.0 mg/L) 3個(gè)質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品各5份，在優(yōu)化條件下測(cè)定，通過(guò)方差分析計(jì)算方法的精密度和準(zhǔn)確度。連續(xù)測(cè)定3 d，獲得日間與日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，結(jié)果見(jiàn)表1。尿液和糞便基質(zhì)中準(zhǔn)確度為94.8%～109%；日間與日內(nèi)精密度為3.6%～9.9%；由結(jié)果可知，方法的精密度和準(zhǔn)確度符合《中國(guó)藥典》(2015版)第四部《9012生物樣品定量分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則》的相關(guān)要求。

表1 氟噻草胺在尿液和糞便中的準(zhǔn)確度和精密度Table 1 Precision and accuracy for the determination of flufenacet in urine and feces

2.2.3加標(biāo)回收率與基質(zhì)效應(yīng)考察了尿液樣品的加標(biāo)回收率與基質(zhì)效應(yīng)。以空白尿液為基質(zhì)將QC工作溶液稀釋成低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度(0.25、1.00、8.00 mg/L)的質(zhì)控樣品各5份，在優(yōu)化條件下測(cè)得氟噻草胺的峰面積A；另取大鼠空白尿液樣品，先加入渦旋混勻的QC工作溶液和內(nèi)標(biāo)溶液，再加入等量低、中、高3個(gè)濃度的QC工作溶液和內(nèi)標(biāo)溶液，每個(gè)濃度平行5個(gè)樣品，分析獲得相應(yīng)峰面積B；另以流動(dòng)相替代空白尿液，加入低、中、高3個(gè)濃度的QC工作溶液，按“1.6”方法操作，每一濃度平行5個(gè)樣本，分析獲得相應(yīng)峰面積C。以A/B×100%計(jì)算加標(biāo)回收率，以B/C×100%計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)。

結(jié)果表明，尿液基質(zhì)中，該方法的加標(biāo)回收率為97.0%～98.8%，RSD為0.5%～9.0%；基質(zhì)效應(yīng)為98.8%～107%，RSD為1.1%～3.4%，表明該分析方法不存在基質(zhì)效應(yīng)；加標(biāo)回收率和基質(zhì)效應(yīng)符合《中國(guó)藥典》(2015版)第四部《9012生物樣品定量分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則》的相關(guān)要求。

表2 尿液與糞便樣品中氟噻草胺的排泄率和累積排泄率Table 2 The excretion rate and total accumulated excretion rate of flufenacet in urine and feces

2.2.4穩(wěn)定性考察以空白尿液、糞便提取液配制2個(gè)質(zhì)量濃度(尿液：0.25、8.00 mg/L;糞便：0.75、40.0 mg/L)的質(zhì)控樣品各5 份?？疾炝四蛞簶悠?3次凍融循環(huán)、室溫放置4 h、處理后進(jìn)樣器放置24 h、生物樣品-20 ℃下放置15 d和30 d)，以及糞便樣品(室溫放置4 h、處理后進(jìn)樣器放置24 h)的穩(wěn)定性。得到尿液與糞便中穩(wěn)定性樣品的峰面積占新鮮配制樣品峰面積的比例分別為93.7%～108%和97.5%～102%，穩(wěn)定性結(jié)果在85%～115%范圍內(nèi)，表明氟噻草胺在以上的儲(chǔ)存條件下穩(wěn)定，符合實(shí)驗(yàn)要求。

2.3 實(shí)際樣品的測(cè)定

大鼠單次經(jīng)口染毒98%氟噻草胺原藥400 mg/kg后，收集大鼠0～7 h、7～24 h、24～48 h、48～72 h、72～96 h、96～144 h的尿樣和糞樣，按照本方法處理后進(jìn)行測(cè)定，尿液與糞便中氟噻草胺在各時(shí)間段的排泄率和累積排泄結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2可知，大鼠經(jīng)口染毒98%氟噻草胺原藥后，原藥可隨糞、尿排泄。0～144 h內(nèi)的總排泄率為12.62%，其中尿中的累積排泄率為1.12%，糞中的累積排泄率為10.13%，糞尿淋洗液的累積排泄率為1.37%；說(shuō)明氟噻草胺在大鼠體內(nèi)主要經(jīng)糞便排泄。大鼠排泄后，代謝籠、糞管、尿管上會(huì)有殘留，用100 mL乙腈充分沖洗獲得糞尿淋洗液并進(jìn)行測(cè)定，以保證總排泄率計(jì)算的準(zhǔn)確性。

3 結(jié) 論

本文建立了一種測(cè)定大鼠尿液、糞便中氟噻草胺濃度的HPLC-MS/MS分析方法。該法高效、專(zhuān)屬、靈敏，符合生物樣品分析方法的要求，可用于尿液、糞便中氟噻草胺的測(cè)定。采用建立的方法對(duì)給藥后大鼠體內(nèi)氟噻草胺的排泄動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示氟噻草胺原藥在大鼠糞和尿中的排泄率較低，可能由于經(jīng)口給藥后，原藥在大鼠體內(nèi)會(huì)被廣泛代謝成相關(guān)的代謝產(chǎn)物，后續(xù)應(yīng)對(duì)其代謝產(chǎn)物做進(jìn)一步考察研究。