（南京市公安局刑事科學(xué)技術(shù)研究所，江蘇 南京 210012）

法醫(yī)需要對(duì)溺水死亡案件中受害人溺水地點(diǎn)、生前溺水或是死后拋尸入水等問(wèn)題進(jìn)行判斷。目前，硅藻檢驗(yàn)的結(jié)果是判斷上述問(wèn)題的重要參考之一。硅藻檢驗(yàn)的方法很多，包括強(qiáng)酸消化法、胰蛋白酶消化法等[1-2]，這些方法的基本原理仍然是依據(jù)硅藻的形態(tài)學(xué)差異進(jìn)行判斷。目前，已有利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)在溺水死亡案件鑒定方面作出開拓性研究成果的報(bào)道，何方剛等[3]以大鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，利用PCR擴(kuò)增和變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）的方法，比較水體和溺水大鼠肺、肝、腎、腦等組織中浮游生物16S核糖體DNA（rDNA）第三區(qū)和第四區(qū)特異性DNA片段序列、長(zhǎng)度的差異，結(jié)果顯示溺死組5只大鼠肺組織全部檢出陽(yáng)性結(jié)果，拋尸組僅1只大鼠檢出陽(yáng)性結(jié)果。

目前，利用新的遺傳標(biāo)記對(duì)藻類進(jìn)行種屬鑒定以及藻類系統(tǒng)發(fā)育學(xué)的研究已經(jīng)取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步。研究者致力于尋找一種可以有效鑒別不同藻類、浮游生物的分子標(biāo)記。在rDNA基因中，5.8S rDNA和28S rDNA基因之間的間隔序列稱為內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）序列，其長(zhǎng)度和堿基序列具有高度特異性，被形象地稱為“藻類鑒定條形碼”。MONIZ等[4]比較了核糖體小亞基（small subunit ribosomal ribonucleic acid，SSU rRNA）序列、細(xì)胞色素 c氧化酶亞基Ⅰ（cytochrome c oxidase subunit Ⅰ，Cox1）、核糖體DNA 5.8S部分序列和第二內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（second internal transcribed spacer，ITS2）序列（5.8S+ITS2）三種主要藻類分子標(biāo)記后，認(rèn)為5.8S+ITS2分子標(biāo)記是目前藻類種屬鑒定、系統(tǒng)發(fā)育分析最好的遺傳標(biāo)記。由于氣候、水文條件的差異，不同水體中優(yōu)勢(shì)種群的藻類組成具有顯著的差異，VINAYAK等[5]以水體中111個(gè)硅藻種類為研究對(duì)象，在不同位置、不同季節(jié)均發(fā)現(xiàn)特異性硅藻種類，可為落水地點(diǎn)和落水時(shí)間的判斷提供依據(jù)。因此，利用5.8S+ITS2分子標(biāo)記對(duì)特定水域與溺水者肺、肝、腎等組織中藻類種屬構(gòu)成的差異進(jìn)行分析，可以對(duì)死者溺水地點(diǎn)以及生前溺水或死后拋尸入水的判斷提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)樣本

以南京市公安局法醫(yī)中心受理的2例硅藻檢驗(yàn)鑒定案例為對(duì)象，其中：案例1為一起落水死亡案件，受害人為女性，系生前遭人毆打并推入水中溺亡；案例2是一起棄嬰案件，系嬰兒死亡后拋尸入水。

提取受害人肺、肝、腎、骨髓等組織于-20℃冷凍保存，取受害人落水地（發(fā)現(xiàn)地）水域的水體樣本于-20℃冷凍保存。

1.2 DNA提取

水體中藻類DNA的提取采用先富集后液氮研磨的方法，人體組織中藻類在提取DNA之前需盡量去除人體組織的DNA，同時(shí)在檢驗(yàn)過(guò)程中取適量受害人血液樣本的DNA作為對(duì)照。以上樣本均按照二氧化硅吸附法提取和純化[6]。用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)提取產(chǎn)物在260 nm和280 nm波長(zhǎng)下光密度的比值（D260/D280），以檢測(cè)DNA的純度和濃度。

1.3 PCR擴(kuò)增與DNA片段檢測(cè)

PCR擴(kuò)增體系總體積為25 μL，內(nèi)含終濃度為200 μmol/L dNTPs 10 μL、1.5 mmol/L MgCl21 μL、1.5μmol/L引物對(duì) 5μL、0.5U Taq DNA 聚合酶 1μL，模板量為5～20ng，其余用去離子水補(bǔ)齊。同一案例的水體和肺組織中擴(kuò)增模板量一致。其中，擴(kuò)增藻類5.8S+ITS2 序列所使用正向引物（5′→3′）為 6-FAMGCATCGATGAAGAACGCAGC，反向引物（5′→3′）為TCCTCCGCTTATTGATATGC[7]，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性 11 min；95℃變性 30 s，53℃退火 40 s，72℃延伸45s，30 個(gè)循環(huán)；60℃保溫 20min。

擴(kuò)增產(chǎn)物在3130xl基因分析儀（美國(guó)AB公司）上進(jìn)行檢測(cè)，獲得的數(shù)據(jù)采用GeneMapper?ID-X v1.4軟件（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）進(jìn)行分析。

1.4 硅藻鏡檢

人體組織和水體中的硅藻鑒定按照《人體組織器官中硅藻硝酸破機(jī)法檢驗(yàn)》（GA/T 813—2008）、《法醫(yī)病理學(xué)檢材的提取、固定、包裝及送檢方法》（GA/T 148—1996）規(guī)定的操作進(jìn)行，經(jīng)發(fā)煙硝酸消化、離心、洗滌、制片、鏡檢，鏡檢采用40倍物鏡觀察、拍照固定。

2 結(jié) 果

2.1 藻類DNA檢測(cè)結(jié)果

案例1中：水體樣本DNA提取產(chǎn)物的D260/D280為1.75，質(zhì)量濃度為10ng/μL；受害人肺組織DNA提取產(chǎn)物的D260/D280為1.78，質(zhì)量濃度為50ng/μL。經(jīng)上述方法檢測(cè)分析的結(jié)果見圖1。受害人肺組織的藻類DNA檢測(cè)中，檢出長(zhǎng)度為330bp和376bp兩條DNA片段。水體樣本的藻類DNA檢測(cè)中，檢出了330bp、348bp、352bp、376bp、385bp 等長(zhǎng)度不一的多條 DNA片段，其中包含330bp和376bp兩條片段。受害人血液樣本的DNA擴(kuò)增產(chǎn)物在300 bp至400 bp區(qū)間未獲得明顯DNA條帶。

案例2中：水體樣本DNA提取產(chǎn)物的D260/D280為1.73，質(zhì)量濃度為12ng/μL；受害人肺組織DNA提取產(chǎn)物的D260/D280為1.74，質(zhì)量濃度為45ng/μL。經(jīng)上述方法檢測(cè)分析的結(jié)果見圖2。受害人肺組織的藻類DNA檢測(cè)中，在300bp至400bp區(qū)間只有一條331bp的DNA片段檢出。水體樣本的藻類DNA檢測(cè)中，檢出 331 bp、368 bp、376 bp、395 bp 等長(zhǎng)度不一的多條DNA片段，其中包含331 bp片段，但相同DNA模板量和擴(kuò)增條件下，受害人肺組織中檢出的DNA片段相對(duì)熒光單位（relative fluorescence unit，RFU）值只有300，而水體樣本中相應(yīng)片段RFU值為3800。對(duì)受害人血液樣本進(jìn)行對(duì)照擴(kuò)增檢測(cè)，未檢出藻類DNA片段。

圖1 案例1的藻類DNA檢測(cè)結(jié)果

圖2 案例2的藻類DNA檢測(cè)結(jié)果

2.2 硅藻鏡檢結(jié)果

對(duì)案例1中受害人的肺、肝、腎、骨髓組織以及疑似落水點(diǎn)水體樣本中硅藻進(jìn)行鏡檢。水體樣本中檢出中心目硅藻13個(gè)、羽紋目硅藻70個(gè)，肺組織中檢出中心目硅藻3個(gè)、羽紋目硅藻44個(gè)，肝組織中檢出中心目硅藻1個(gè)、羽紋目硅藻2個(gè)，腎和骨髓組織中未檢見硅藻。結(jié)合案例1實(shí)際案情，硅藻檢驗(yàn)結(jié)果符合生前溺水的特征。

對(duì)案例2中受害人的肺、肝、腎以及疑似落水點(diǎn)水體樣本中硅藻進(jìn)行鏡檢。水體樣本中檢出中心目硅藻16個(gè)、羽紋目硅藻36個(gè)，肺、肝、腎組織中均未檢出硅藻。案例2中的受害人是無(wú)名棄嬰，系死亡后被拋入水中，硅藻檢驗(yàn)結(jié)果符合死后拋尸入水的特征。

3 討 論

3.1 分子標(biāo)記的選擇

5.8 S+ITS2分子標(biāo)記一直是真菌類種屬鑒定的有效工具，SCHOCH等[8]分析了RNA聚合酶Ⅱ最大亞基、RNA聚合酶Ⅱ第二亞基等多個(gè)候選分子標(biāo)記發(fā)現(xiàn)，ITS序列是鑒定真菌最有效的分子標(biāo)記之一。MONIZ等[9]分析了618個(gè)硅藻DNA片段，運(yùn)用5.8S+ITS2分子標(biāo)記檢測(cè)具有非常高的種屬特異性和片段擴(kuò)增成功率，是最為有效且經(jīng)濟(jì)的鑒定標(biāo)記。此外，為了獲得更高的多態(tài)性，可以選擇多個(gè)分子標(biāo)記攜帶不同顏色的熒光修飾基團(tuán)進(jìn)行擴(kuò)增分析。本研究發(fā)現(xiàn)，人體組織中獲得的DNA片段條帶數(shù)均明顯低于水體樣本中檢出的條帶數(shù)，由于較少的DNA片段限制了鑒定意見的分析，因此有必要增加分子標(biāo)記，在人體組織中獲得更多的目標(biāo)DNA片段。WHITE等[7]推薦的序列還包括核糖體大亞基和小亞基的部分特異性序列以及線粒體DNA序列中的多個(gè)分子標(biāo)記，選擇合適的標(biāo)記組合是下一步研究的任務(wù)。

3.2 DNA提取方法對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響

水體樣本中藻類DNA的提取方法主要是通過(guò)高速離心、富集水體中浮游藻類、液氮研磨破碎細(xì)胞來(lái)提取總DNA。對(duì)于受害人肺組織中藻類DNA的提取則有所不同，需先通過(guò)含有蛋白酶K的混合緩沖溶液消化肺組織，高速離心后棄去上清液保留沉淀，其目的是盡量去除人體組織中的DNA。由于藻類生物中有部分是沒(méi)有細(xì)胞壁的單細(xì)胞浮游藻類，這一方法將不可避免地導(dǎo)致?lián)p失部分藻類，可能是肺組織中檢出的DNA片段條帶數(shù)少于水體樣本的原因之一。本研究也曾嘗試直接用液氮研磨肺組織然后提取總DNA，檢測(cè)結(jié)果不理想，可能是該方法提取的DNA主要是人體組織DNA的緣故。如何提取肺組織中的藻類DNA也是本研究的難點(diǎn)之一，目前看來(lái)，先去除人體組織的DNA是較為理想的方法。

3.3 檢測(cè)結(jié)果與分析

案例1中，根據(jù)尸體檢驗(yàn)、案情調(diào)查和硅藻檢驗(yàn)結(jié)果，都支持受害人系生前溺水，本研究在受害人肺組織和水體樣本中均檢出330bp和376bp兩種5.8S+ITS2 DNA片段，水體樣本中還檢出了348bp、352bp等多條DNA片段。案例2中，硅藻鏡檢僅在水體樣本中檢出硅藻，受害人肺、肝、腎組織中均未檢出硅藻，案情調(diào)查證實(shí)，受害人（嬰兒）在醫(yī)院經(jīng)治療無(wú)效死亡后被拋入水中。本研究在受害人肺組織中僅檢出一條331 bp的5.8S+ITS2 DNA片段，RFU值為300，量非常少，水體樣本中則檢出 331bp、368bp、376bp、395bp等長(zhǎng)度的DNA片段，具有較高的多樣性，其中也包括331bp片段，其RFU值為3800。本研究結(jié)果顯示：生前溺水死亡的死者肺組織中的硅藻DNA片段與水體樣本中的硅藻DNA片段在大小、種類等方面有更高的一致性，而死后拋尸入水的案例則未在肺組織中檢出特異性DNA片段。本研究也對(duì)受害人肝、腎等組織進(jìn)行了檢驗(yàn)，受限于缺乏高效的藻類DNA提取手段未能檢出特異性DNA片段。此外，受害人組織和水體樣本中的DNA片段多態(tài)性相似程度達(dá)到何種標(biāo)準(zhǔn)時(shí)可以出具支持拋尸入水或生前溺水的鑒定意見，同樣需要在檢驗(yàn)大量案例并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析的基礎(chǔ)上，將5.8S+ITS2分子標(biāo)記檢驗(yàn)的結(jié)果結(jié)合實(shí)際案情、尸體檢驗(yàn)及組織病理學(xué)檢驗(yàn)結(jié)果，最終得出結(jié)論。