黨海珍，焦順昌，吳亮亮，姜忠華

T淋巴細胞亞群是機體免疫監(jiān)視的一道重要防線，無須預先抗原激活就具備對某些腫瘤細胞的殺傷作用。T細胞是種類繁多、功能復雜的一類免疫細胞。T細胞的調節(jié)和活化機制十分復雜，是保持免疫狀態(tài)、控制腫瘤生長和轉移的重要一環(huán)。此外，巨噬細胞和T淋巴細胞均可分泌釋放TNF，后者是局部免疫的重要組成部分，對抗腫瘤生長和擴散起重要作用。雖然諸多證據(jù)表明，機體免疫功能的低下可促使腫瘤發(fā)生轉移，但也有相反的實驗證據(jù)存在。在一些實驗中有人通過抑制機體免疫，發(fā)現(xiàn)無論對原發(fā)瘤或轉移擴散均有促發(fā)效應，有可能與免疫逃逸或免疫耐受機制有關。

有研究發(fā)現(xiàn)淋巴細胞亞群的分布與年齡、性別、種族等因素相關［1］。對不同年齡、性別的健康成年人21項淋巴細胞亞群之間的差異進行分析，結果顯示， 性別對 CD3－CD16+，CD56+、CD8+CD28+的影響具有統(tǒng)計學意義［2］，年齡對 CD3+、CD3+CD8+、CD3－CD16+，CD56+、CD8+CD28+、CD4+CD25+的影響具有統(tǒng)計學意義。筆者通過檢測胃癌患者手術前后T淋巴細胞亞群的變化，并與健康人群相對照，分析其與臨床病理特征及術后無病生存期（DFS）的關系，探討胃癌患者手術前后T淋巴細胞亞群在外周血的表達對預后的影響，為建立胃癌術后輔助化療的個體化模式提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 病例資料2010年1月—2011年6月在解放軍總醫(yī)院行手術治療Ⅰ～Ⅲ期的胃癌病例41例；男34 例，女 7 例；年齡 40～81 歲，平均（59.32±11.41）歲。健康對照組41例，為中國人民解放軍總醫(yī)院2009年10月—2010年01月健康體檢的職工；其中男26名，女15名；年齡21～86歲，平均 （43.64±22.08）歲；健康體檢者常規(guī)體檢指標正常，均無腫瘤家族史。

1.2 研究內(nèi)容將所有病例臨床特征如性別、年齡、癥狀、飲酒史、脈管癌栓、腫瘤大體形態(tài)、腫瘤分化、Lauren分型、T分期、N分期、TNM分期列為觀察指標，錄入Excel表，并對收集病例進行隨訪，每半年1次統(tǒng)計隨訪資料，并計算DFS。

1.3 試驗方法患者手術當天、術后第10天清晨空腹抽取3 ml靜脈血于EDTA－K3抗凝管中，健康體檢者清晨空腹抽取3 ml靜脈血于EDTA－K3抗凝管中，立即送檢。標注清楚樣品信息（姓名、性別、年齡、ID號、細胞類型、時間等），樣品在送檢后進行處理，經(jīng)細胞計數(shù)后，調整細胞的濃度至5×105/ml，最后用1×PBS重懸細胞，用300目的濾網(wǎng)過濾黏連細胞；加入檢測抗體及同型對照抗體，分為兩種檢測組合抗體， 分別為：CD4－FITC、CD8－PE、CD3－PC5；CD16－FITC、CD56－PE、CD3－PC5，加入檢測抗體后，分別在另外的試管中加入相應的同型對照抗體 （檢測抗體和同型對照抗體的量按照抗體說明書），手持試管輕輕搖勻，室溫（16～22 ℃），避光放置20～30 min。 依次向各試管中加入 1 ml 1×PBS，1200R，10 min，棄上清。 加入 500 μl 1×PBS 漩渦震蕩5～10 s，待上機檢測。試劑：同型對照抗體及測定抗體均為貝克曼庫爾特公司；儀器：流式細胞儀等。

1.4 檢測及結果分析熒光校準微球：Flow－Check TM Fluorospheres校正儀器，HPCV值＜3%確保機器狀態(tài)良好；在流式細胞儀MXP分析軟件上打開淋巴細胞亞群，檢測方案嚴格按試劑盒要求進行：實驗完成后檢驗樣品中 CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3+CD16+CD56+（NKT）、CD3 －CD16+CD56+（NK），統(tǒng)計各亞群百分比數(shù)。

1.5 統(tǒng)計學處理應用SPSS 17.0軟件包，對兩個或多個變量元素選用χ2檢驗，應用Kaplan-Meier生存分析，對某一變量的分析選擇Log-rank檢驗，多因素指數(shù)體系選擇COX回歸，無病生存期以（±s）表示，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 患者臨床及病理特點外科手術方式包括腹腔鏡輔助胃癌根治術備全胃切除術32例（78.05%），胃癌根治+化療泵置入術9例（21.95%）；病理類型包括低分化腺癌12例（29.27%），中分化腺癌6例（14.63%），高分化腺癌 12 例（29.27%），印戒細胞癌3例（7.32%），黏液腺癌 5例（12.20%），管狀腺癌 1例（2.44%），乳頭狀腺癌 1例（2.44%），低分化癌肉瘤 1例 （2.44%）；分化程度包括低分化 13例（31.71%）， 中分化 6例 （14.63%）， 高分化 12例（29.27%），以及印戒細胞癌及黏液腺癌等未能判斷分化程度者10例（24.39%）。

T分期包括T1a期3例 （7.32%），T1b期 2例（4.88%），T2期 2例（4.88%），T3期 7例（17.07%），T4a期 13例（31.71%），T4b期 14例（34.15%）；N 分期包括N0期13例（31.71%），N1期7例（17.07%），N2期 7例（17.07%），N3a期 6例（14.63%），N3b期8例（19.51%）；臨床分期ⅠA 期 5例（12.20%），ⅡA期 1例（2.44%），ⅡB 期 3例（7.32%），ⅢA 期 7例（17.1%）， ⅢB期 14例 （34.15%）， ⅢC期 11例（26.83%）。

2.2 臨床病理與預后相關性對41例胃癌術后患者進行臨床病理特點與預后（DFS）相關的單因素分析，年齡、癥狀、TNM分期、手術切緣與DFS相關。年齡＜60歲與≥60歲患者中位DFS分別為18和15個月，DFS生存率分別為81.82%與68.18%，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；確診時有癥狀和無癥狀者中位DFS分別為17個月和22個月，DFS生存率分別為77.27%與100%（P＜0.05）；TNM分期Ⅰ期/Ⅱ期、Ⅲ期中位DFS分別22和16個月，DFS生存率分別為100%與72.73%（P＜0.01）；患者手術切緣陰性與陽性中位DFS為17和5個月，DFS生存率分別為77.27%與12.20%（P＜0.05）。其他如性別、飲酒史、Lauren分型、脈管癌栓、癌細胞分化、合并慢性病、大體形態(tài)、術式、混合病理類型、放療等因素對DFS的影響均無顯著性差異（P＞0.05）。見表1。

2.3 手術前后外周血T淋巴細胞亞群的變化外周血T細胞CD3+、CD3+CD4+、CD4+/CD8+的表達，胃癌術前組分別與健康對照組、胃癌術后組相比明顯降低， 差異具有統(tǒng)計學意義 （P＜0.05，P＜0.01）；CD3+CD8+的表達，胃癌術前組分別與健康對照組、胃癌術后組比較增高，差異具有統(tǒng)計學意義 （P＜0.05，P＜0.01）；CD8+CD28+的表達，胃癌術前組與健康對照組比較降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；CD4+CD25+的表達，胃癌術前組、術后組分別與健康對照組比較明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。結果見表2。

2.4 T淋巴細胞亞群各項指標表達對預后影響的分析筆者以健康對照組數(shù)據(jù)為標準，對T淋巴細胞亞群各項指標與預后（DFS）進行單因素分析，僅胃癌患者術后第10天外周血CD3+CD4+的表達與DFS相關。如表3所示，術后第10天CD3+CD4+低表達與高表達中位DFS分別為16個月和18個月（圖1）， 差異有統(tǒng)計學意義 （P＜0.05）； 術前CD3+CD4+低表達與高表達中位DFS分別為16個月和22個月，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。其余各項指標與DFS的差別均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表 1 41例胃癌術后患者臨床病理特點與DFS的單因素分析

2.5 T淋巴細胞亞群對DFS影響的COX生存分析選擇胃癌患者手術前后CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD4+/CD8+、CD8+CD28+、CD8+CD28－、CD4+CD25+、CD3－CD16+，CD56+、CD3+CD16+，CD56+等因素進行COX回歸分析。結果顯示，在該組病例中，胃癌患者術后CD3+、CD3+CD8+和CD3－CD16+，CD56+的表達是DFS的獨立預后因素。如表4所示，胃癌患者術后外周血CD3+、CD3－CD16+，CD56+低表達較高表達，CD3+CD8+高表達較低表達，疾病復發(fā)轉移風險分別為0.273、2.595、5.394倍。見表4。

表 2 胃癌患者手術前后外周血T淋巴細胞亞群的表達（±s，%）

表 2 胃癌患者手術前后外周血T淋巴細胞亞群的表達（±s，%）

注：胃癌術前組與健康對照組比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；胃癌術后組與健康對照組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；胃癌術后組與術前組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

組別 CD3+ CD3+CD4+ CD3+CD8+ CD4+/CD8+ CD8+CD28+ CD8+CD28－ CD4+CD25+ CD3－CD16+56+健康對照組 69.11±9.25 39.10±7.12 25.69±7.84 1.72±0.74 16.35±5.20 14.50±6.66 7.47±2.98 12.41±7.93胃癌術前組 64.32±10.12＊ 33.29±7.56＊＊ 29.12±7.46＊ 1.26±0.51＊＊ 13.75±5.29＊ 17.19±7.53 9.32±3.02＊＊ 10.15±7.92胃癌術后組 68.22±7.57△ 37.59±9.56△ 25.26±6.05△△ 1.62±0.72△△ 15.12±4.52 16.16±7.09 9.69±3.58▲▲ 12.82±6.00

表 3 T淋巴細胞亞群各項指標表達與DFS的關系（±s）

表 3 T淋巴細胞亞群各項指標表達與DFS的關系（±s）

T淋巴細胞亞群（%） 術前DFS（月） P值 術后DFS（月） P值CD3+ 0.087 0.143＜69.11 16.00±0.57 16.00±0.61≥69.11 19.00±0.57 18.00±0.89 CD3+CD4+ 0.073 0.032＜39.10 16.00±0.60 16.00±0.42≥39.10 22.00±0.00 18.00±0.67 CD3+CD8+ 0.210 0.133＜25.69 20.00±3.06 19.00±1.93≥25.69 17.00±0.57 16.00±0.71 CD4+/CD8+ 0.439 0.370＜1.72 17.00±0.99 16.00±0.86≥1.72 15.00±5.99 17.00±0.73 CD8+CD28+ 0.974 0.399＜16.35 17.00±1.00 17.00±1.71≥16.35 15.00±1.77 18.00±1.07 CD8+CD28－ 0.536 0.228＜14.50 17.00±1.58 18.00±1.12≥14.50 17.00±1.15 16.00±0.41 CD4+CD25+ 0.301 0.725＜7.47 19.00±1.26 18.00±1.41≥7.47 16.00±0.62 16.00±0.86 CD3－CD16+，CD56+ 0.885 0.268＜12.41 17.00±0.58 19.00±0.30≥12.41 18.00±2.69 16.00±0.48 CD3+CD16+，CD56+ 0.749 0.075＜8.51 17.00±0.86 18.00±0.79≥8.51 19.00±0.00 16.00±0.61

圖 1 術后第10天CD3+CD4+表達與DFS關系

表 4 術后T淋巴細胞亞群對DFS影響的COX生存分析

3 討論

研究資料表明，胃癌發(fā)病率及死亡率與性別、地域有相關性。納入研究的41例胃癌病例，其中男34例（82.9%），女 7例（17.1%）；中位年齡為 59歲（40～81 歲）；有飲酒史 12 例（29.3%）；有腫瘤家族史10例（24.4%）；治療前有其他伴隨疾病者25例（60.9%）；確診前有明確癥狀者37例（90.2%），常見癥狀依次為：上腹部不適（疼痛、脹悶）、進食時哽噎感、便血、嘔血、乏力等。此次入組病例各臨床特征分布較均勻，全部病例隨訪時間為10～256個月，中位隨訪期為65個月，截至該研究隨訪終點2017年6月30日，出現(xiàn)疾病復發(fā)或轉移者27例，其中6例（14.63%）死亡，1例失訪，均未達到中位生存期，1年、2年和3年的總生存率分別為95.12%、90.24%和82.93%；有1例死于骨髓抑制引起的肺部感染，2例死于繼發(fā)的肝轉移癌，3例死亡原因不詳，14例截至隨訪終點未監(jiān)測到腫瘤復發(fā)或轉移，中位DFS為 17個月，平均（17.00±0.77）個月，1年無病生存期（DFS）生存率為70.6%。由于該研究對象為能手術切除腫瘤的Ⅰ～Ⅲ期胃癌患者，所以選擇能準確反映術后輔助治療的DFS作為主要觀察指標。

對41例胃癌術后臨床病理特點與預后（DFS）相關性的單因素分析結果顯示：年齡、癥狀、TNM分期、手術切緣與DFS相關。其他如性別、飲酒史、Lauren分型、脈管癌栓、癌細胞分化、合并慢性病、大體形態(tài)、術式、混合病理類型等因素對DFS的影響均無顯著性差異。有研究顯示淋巴細胞亞群的分布與年齡、性別、種族等因素相關［1］，還有研究發(fā)現(xiàn)［3］胃癌患者外周血CD3+細胞、CD4+細胞、CD4+/CD8+細胞比值均明顯低于正常人，而CD8+細胞則明顯高于正常人。該研究發(fā)現(xiàn)外周血T細胞CD3+、CD3+CD4+、CD4+/CD8+的表達，胃癌術前組低于健康對照組、胃癌術后組（P＜0.05，P＜0.01）；CD3+CD8+的表達，胃癌術前組高于健康對照組、胃癌術后組（P＜0.05，P＜0.01）；研究結果提示胃癌患者均存在免疫功能紊亂，與既往研究結果相一致［4－6］。 該研究結果顯示胃癌術后與術前相比，患者外周血中CD3+、CD3+CD4+、CD4+/CD8+水平有所升高，CD3+CD8+表達下降，兩組比較差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，P＜0.01）；而胃癌術后組與健康對照組相比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），結果提示手術切除腫瘤對宿主免疫抑制的恢復有所幫助。有研究證實胃癌的進展與 T 細胞免疫反應減弱相關［7，8］，該研究顯示胃癌術前患者 CD3+CD8+水平增高，與文獻報道一致［9－12］。

胃癌浸潤、轉移中，淋巴細胞的免疫功能是構成機體免疫防御功能的重要因素。該研究結果顯示，胃癌術前組外周血T細胞CD8+CD28+的表達低于健康對照組（P＜0.05），CD8+CD28－的表達高于健康對照組，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。研究結果顯示胃癌患者CD8+CD28+低于正常組，與文獻報道相符［13，14］。 CD8+CD28－的表達雖然較健康對照組增高，但無統(tǒng)計學意義，分析可能樣本數(shù)較少，有待進一步擴大樣本量進行研究。該研究顯示外周血T細胞CD8+CD28+的表達，胃癌術后組高于胃癌術前組，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。胃癌術前組患者外周血CD8+CD28+T細胞明顯降低，提示胃癌患者宿主免疫功能處于抑制狀態(tài)，與文獻報道一致［15］。該研究證實機體的免疫功能與腫瘤的發(fā)生及發(fā)展有密切的關系。腫瘤免疫學研究顯示患者預后可能與免疫狀態(tài)有關，該研究結果提示增強免疫力可能會達到抗腫瘤的目的。

由于該研究對象為能手術切除的Ⅰ～Ⅲ期胃癌，較OS相比，DFS更能準確反映術后輔助治療的療效，因此在該研究中，以健康對照組數(shù)據(jù)為標準，對T淋巴細胞亞群各項指標與預后（DFS）進行單因素分析，研究發(fā)現(xiàn)胃癌患者術后第10天外周血CD3+CD4+的表達與DFS相關，胃癌患者術后第10天CD3+CD4+低表達與高表達中位DFS分別為16個月和18個月，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而胃癌患者術前CD3+CD4+低表達與高表達中位DFS分別為16和22個月，但差異無統(tǒng)計學意義 （P＞0.05）。研究結果提示胃癌患者術后CD3+CD4+細胞表達正常腫瘤復發(fā)轉移風險降低。選擇胃癌患者手術前后T淋巴細胞亞群 CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD4+/CD8+、CD8+CD28+、CD8+CD28－、CD4+CD25+、CD3－CD16+，CD56+、CD3+CD16+，CD56+等因素進行COX回歸分析，結果顯示，在該組病例中，胃癌患者術后CD3+、CD3+CD8+和CD3－CD16+，CD56+的表達是DFS的獨立預后因素，胃癌患者術后外周血CD3+低表達疾病復發(fā)轉移風險是高表達的27.3%，而CD3－CD16+，CD56+低表達較高表達、CD3+CD8+高表達較低表達疾病復發(fā)轉移風險分別為2.595、5.394倍。研究結果顯示胃癌生存時間與機體免疫功能紊亂和低下密切相關。因此，在胃癌患者治療過程中，定期對機體免疫系統(tǒng)的評價及調整可能為腫瘤的治療提供新的思路，通過腫瘤患者T淋巴細胞亞群的檢測，進一步加大樣本量的研究，可能為抗腫瘤治療提供新的依據(jù)及途徑。