何韻晗，葛賓倩，張錢麗，李惠玲，*

（1.蘇州大學(xué) 附屬第一醫(yī)院，江蘇 蘇州 215006；2.蘇州大學(xué) 護(hù)理學(xué)院，江蘇 蘇州 215006；3.蘇州科技大學(xué) 化學(xué)生物與材料工程學(xué)院，江蘇 蘇州 215009）

重金屬對(duì)人體健康具有危害已形成共識(shí)，其中鉛對(duì)人體的嚴(yán)重毒害作用是已經(jīng)被廣泛認(rèn)可的事實(shí)，可造成全身所有組織臟器、尤其是神經(jīng)系統(tǒng)的嚴(yán)重?fù)p害。研究表明，血鉛超標(biāo)可嚴(yán)重影響胎/嬰幼/少兒的神經(jīng)系統(tǒng)和智力發(fā)育，造成智商明顯下降[1－4]。而且，人體對(duì)鉛的主動(dòng)代謝排出能力極弱，沉積于骨骼內(nèi)鉛的半衰期為20年[5]，在無(wú)外來(lái)因素作用下，人體內(nèi)鉛的濃度將隨年齡呈逐步增加趨勢(shì)。現(xiàn)有的國(guó)際通行標(biāo)準(zhǔn)（包括我國(guó)）視血鉛 ＞100 μg·L－1為輕度鉛中毒指標(biāo)，但美國(guó)疾病預(yù)防控制中心（CDC）、美國(guó)國(guó)家毒理學(xué)項(xiàng)目（NTP，2012 年 6 月）等已明確指出，在血鉛濃度 ＜100 μg·L－1、甚至低于 50 μg·L－1的水平，就可能已導(dǎo)致不良健康效應(yīng)[6]。尹華等曾報(bào)道過(guò)大蒜粗提取物對(duì)人體的排鉛作用[7]，Mahdi等通過(guò)與排鉛藥物青霉胺[8]的對(duì)比研究，亦提出以大蒜作為促進(jìn)排鉛的功能食品[9]。有研究表明，大蒜精制提取物（大蒜精油）能更有效地起到人體排鉛作用[10]。

大蒜既作為食物佐料，也具有眾多的保健和治療作用[11－12]。1858年，法國(guó)的路易·巴斯德首先發(fā)現(xiàn)了大蒜的抗菌活性[13]，美國(guó)的Bordia在1981年報(bào)道了大蒜能防止血漿膽固醇升高和降低血脂作用[14]。大蒜還可以預(yù)防血栓的形成、降低心臟病發(fā)作和中風(fēng)的風(fēng)險(xiǎn)，并能提高機(jī)體免疫力、產(chǎn)生抗癌作用[15]。

大蒜中含有大量的硫化物，如蒜氨酸、大蒜辣素、大蒜素、大蒜新素等。從大蒜中提取的生物活性成分——大蒜精油已被用于食品、保健食品及醫(yī)藥（替代抗生素）等領(lǐng)域[16－17]。大蒜精油是在加工過(guò)程中自然分解、轉(zhuǎn)化形成的揮發(fā)性成分（包括40多種硫醚類化合物），占大蒜總量的0.1%～0.2%。報(bào)道指出，這些含硫分子作為天然硫源與包括鉛在內(nèi)的重金屬相互作用，從而起到排鉛解毒作用[7，9，10，18]，然而早期的研究均未闡明這種排鉛作用的機(jī)理。Benavides等詳細(xì)研究了大蒜精油所含硫醚類化合物的降解機(jī)制，指出在谷胱甘肽的作用下，其最終降解產(chǎn)物為H2S[19]；其后，Hou等則詳細(xì)綜述了大蒜中含硫化學(xué)成分的轉(zhuǎn)化機(jī)理，較為完整地闡述了其最終轉(zhuǎn)化為H2S的化學(xué)過(guò)程[20]。筆者通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究闡明了大蒜精油排鉛的化學(xué)機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

X 光電子能譜（XPS）儀：ESCALAB 250 X－ray Photoelectron Spectroscopy，ThermoFisher Scientific（USA），Al Kα 源（Mono Al Kα ），能量：1 486.6 eV。

恒溫震蕩儀：杭州奧盛儀器有限公司。

大蒜精油（garlic essential oil，CAS：8000－78－0）：系大蒜經(jīng)純物理工藝提取制得的揮發(fā)性精油，由昆山市綠淵香料有限公司提供。食品添加劑許可證號(hào)為蘇XK13－217－00317，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為GB1886.272－2016/美國(guó)食品化學(xué)法典（第七版：各論/蒜油347），經(jīng)美國(guó)喬治亞大學(xué)Center for Applied Isotope Studies進(jìn)行14C鑒定，此產(chǎn)品為全天然提取物（參考活性為13.8 dpm/gC，全等于目前地球14C背景參考值）。

L－還原型谷胱甘肽（GSH）：純度＞98%，購(gòu)自 Sigma－Aldrich 公司。

Pb（NO3）2：GR，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

超純水：自制。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

論文旨在通過(guò)體外模擬，驗(yàn)證大蒜精油在谷胱甘肽作用下降解所形成的產(chǎn)物及與Pb2+相互作用的產(chǎn)物，以確認(rèn)H2S的形成是其排鉛作用的化學(xué)機(jī)制。驗(yàn)證反應(yīng)以大蒜精油、谷胱甘肽和Pb2+為反應(yīng)起始物，通過(guò)模擬體溫條件下反應(yīng)，驗(yàn)證其反應(yīng)產(chǎn)物；同時(shí)，設(shè)立若干個(gè)對(duì)照組和空白組進(jìn)行比對(duì)，以判定上述反應(yīng)中谷胱甘肽的決定性作用。具體實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)組如下：

實(shí)驗(yàn)組：取潔凈試管，加大蒜精油 100 μL、10 mmol·L－1Pb（NO3）2溶液 900 μL，混勻，加入谷胱甘肽20 mg（E管）。試管口置濕潤(rùn)的硝酸鉛試紙，密塞。于37℃恒溫震蕩反應(yīng)過(guò)夜，觀察反應(yīng)現(xiàn)象。

對(duì)照組：（1）大蒜精油 100 μL+谷胱甘肽 20 mg+水900 μL（A 管），（2）谷胱甘肽 20 mg+10 mmol·L－1Pb（NO3）2溶液 900 μL+水 100 μL（F 管），（3）大蒜精油 100 μL+10 mmol·L－1Pb（NO3）2溶液 900 μL（G 管）。分別置潔凈試管中，混勻后，試管口各置濕潤(rùn)的硝酸鉛試紙，密塞。分別于37℃恒溫震蕩反應(yīng)過(guò)夜，觀察反應(yīng)現(xiàn)象。

空白組：（1）大蒜精油 100 μL+水 900 μL（B 管），（2）谷胱甘肽 20 mg+水 1 mL（C 管），（3）大蒜精油 1 mL（D 管），（4）10 mmol·L－1Pb （NO3）2溶液 1 mL （H 管），（5）水 1 mL（I管）。操作同“對(duì)照組”。

1.3 產(chǎn)物驗(yàn)證

上述反應(yīng)組中，將分別可能有氣體或沉淀生成，通過(guò)定性試紙對(duì)氣體進(jìn)行鑒定。將實(shí)驗(yàn)所得反應(yīng)沉淀產(chǎn)物經(jīng)離心分離、水充分洗滌并烘干后，利用X光電子能譜（XPS）技術(shù)進(jìn)行定性檢測(cè)，判斷該沉淀化學(xué)組成。

2 結(jié)果和討論

2.1 結(jié)果

各組的反應(yīng)現(xiàn)象如圖1、圖2所示。由圖1可見(jiàn)，“大蒜精油+GSH”組的硝酸鉛試紙變黑，其他各組的硝酸鉛試紙均變色不明顯，說(shuō)明大蒜精油在谷胱甘肽的催化作用下，產(chǎn)生了H2S氣體。

圖1 谷胱甘肽（GSH）催化大蒜精油分解產(chǎn)生H2S試驗(yàn)圖

圖2試驗(yàn)組E管（大蒜精油+Pb（NO3）2+GSH）不但硝酸鉛試紙變黑，而且產(chǎn)生黑色沉淀。F管（Pb（NO3）2+GSH）產(chǎn)生少量絮狀物質(zhì)，硝酸鉛試紙未變色。其他各組的硝酸鉛試紙均未變色。

圖2 大蒜精油體外排鉛實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證圖

由XPS鑒定圖譜（圖3）可知，E管黑色沉淀（大蒜精油/Pb2+/谷胱甘肽反應(yīng)產(chǎn)物）主要成分為Pb和S，即為PbS。F管中的少量白色絮狀沉淀可認(rèn)為是Pb2+和GSH之間通過(guò)巰基作用形成的低溶解度的配合物[21]。

圖3 大蒜精油/Pb/谷胱甘肽反應(yīng)產(chǎn)物XPS鑒定結(jié)果

2.2 討論

2.2.1 鉛中毒的毒理機(jī)制

鉛的毒性機(jī)理主要表現(xiàn)在對(duì)含有巰基的一些酶的抑制作用[22]。鉛會(huì)抑制血紅素合成酶（亞鐵螯合酶，ferrochelatase， 琥珀酰輔酶 A，succinyl coenzyme A，CoA），阻礙原卟啉與二價(jià)鐵結(jié)合成血紅素[23]并進(jìn)而影響細(xì)胞色素C的合成，導(dǎo)致腦內(nèi)細(xì)胞色素C濃度降低，影響氧化磷酸化過(guò)程，干擾神經(jīng)細(xì)胞的代謝。與此同時(shí)，鉛亦抑制δ－氨基－γ－酮戊酸脫水酶（ALAD）的活性，使δ－氨基－γ－酮戊酸（ALA）合成膽色素原（prophobilinogen，BPG）[24]的過(guò)程受阻，導(dǎo)致血液中的ALA升高并透過(guò)血腦屏障進(jìn)入腦組織，競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合與其化學(xué)結(jié)構(gòu)相似的γ－氨基丁酸（GABA）的受體，影響GABA的功能，引起神經(jīng)行為學(xué)改變。

2.2.2 大蒜精油的排鉛功能

有文獻(xiàn)報(bào)道了大蒜及粗提取物對(duì)小鼠和人體排出鉛、降低鉛中毒危害的作用[7，18，25]，而最新研究表明，大蒜精油對(duì)人體的排鉛功能更為顯著[10]，32例志愿者每天口服大蒜精油10 mg共4周后，排鉛率＞50%的達(dá)68.7%，50%～25%的為21.9%，＜25%的為9.4%。

2.2.3 大蒜精油排鉛機(jī)理分析

大蒜精油中烯丙基硫醚類化合物的含量占50%～80%，最主要的組分是二烯丙基硫醚、二烯丙基二硫醚、二烯丙基三硫醚、甲基烯丙基硫醚、烯丙基甲基二硫醚等，占大蒜精油含量的60%以上。研究表明[19－20]，大蒜精油中的烯丙基多硫醚在被人體吸收后經(jīng)谷胱甘肽的作用可分解出H2S，由此可預(yù)期具有排鉛的作用。

體外驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)顯示，在37℃條件下，將大蒜精油與GSH混合，可使置于瓶口的硝酸鉛試紙變色（圖1－A管），提示反應(yīng)產(chǎn)物中有H2S氣體生成。在相同反應(yīng)條件下，大蒜精油或GSH單獨(dú)存在時(shí)，硝酸鉛試紙幾不變色。以上事實(shí)證明大蒜精油在GSH作用下確實(shí)降解生成H2S氣體，且反應(yīng)條件相對(duì)溫和。

使用Pb（NO3）2溶液作為檢驗(yàn)試液，以大蒜精油和GSH為反應(yīng)物，進(jìn)行體外反應(yīng)模擬試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在大蒜精油或GSH單獨(dú)存在的條件下，與Pb（NO3）2反應(yīng)無(wú)黑色沉淀生成；GSH與硝酸鉛反應(yīng)僅有少量絮狀物，且硝酸鉛試紙不變色（F管）；大蒜精油及GSH同時(shí)存在的情況下，可與Pb（NO3）2溶液反應(yīng)生成黑色沉淀，且瓶口硝酸鉛試紙變黑，指示有H2S氣體生成（E管）。Pb（NO3）2溶液和純水作為對(duì)照（H管和I管），試紙均無(wú)顏色變化。圖2中E管中生成的黑色沉淀經(jīng)XPS檢測(cè)，主要成分為Pb和S，由此可以證實(shí)大蒜精油在谷胱甘肽的催化作用下可產(chǎn)生H2S，并與鉛反應(yīng)生成PbS。

H2S是繼NO、CO之后被發(fā)現(xiàn)的第三種氣體遞質(zhì)（gasotransmitter）分子[26]，具有包括平滑肌和血管舒張等重要的生理功能[27－30]，近年有論文持續(xù)報(bào)道硫化氫作為信號(hào)分子在生命過(guò)程中的意義和機(jī)理，指出其對(duì)心血管系統(tǒng)的有利影響[31－33]，筆者結(jié)論與其能相互印證，證明了大蒜及其制品大蒜精油的健康效應(yīng)可能主要源于H2S的生成。

研究表明體內(nèi)鉛與含硫蛋白質(zhì)之間形成三級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)松散、熱力學(xué)不夠穩(wěn)定的Cys－S－Pb－S－Cys配合物，其穩(wěn)定常數(shù)為lgK穩(wěn)＝6.06[34]。臨床藥物依地酸鈣（CaEDTA）的配位穩(wěn)定常數(shù)為lgK穩(wěn)＝18.3；D－青霉胺（DPenicillamine，β，β－二甲基半胱氨酸）配位穩(wěn)定常數(shù)為lgK穩(wěn)＝12.26[35]，兩者均可從Pb－蛋白質(zhì)結(jié)合物中置換出鉛，從而產(chǎn)生排鉛作用。而H2S能與鉛生成更穩(wěn)定的沉淀（Ksp＝1.0×10－28），遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于鉛與蛋白質(zhì)的結(jié)合常數(shù)，也大于上述兩個(gè)常用排鉛藥物，因而大蒜精油被人體吸收代謝后生成的H2S可產(chǎn)生強(qiáng)烈的排鉛作用，排鉛更徹底。由于大蒜精油在被人體吸收后是在代謝過(guò)程中逐步分解生成H2S的，因此，其與鉛的結(jié)合是一個(gè)均相沉淀過(guò)程，可生成極小的膠體質(zhì)粒，完全可以經(jīng)由腎臟排出（腎臟透過(guò)的臨界分子量是6.8 KD左右），即使生成稍大的沉淀顆粒，也可隨膽汁經(jīng)由肝腸循環(huán)隨糞便排出[36]。由于通過(guò)口服攝入轉(zhuǎn)化為H2S的量是有限的，因此，經(jīng)常服用大蒜精油不會(huì)導(dǎo)致人體有益微量元素的損失。對(duì)于人體直接食用的大蒜，進(jìn)入體內(nèi)緩慢分解釋放出來(lái)的硫醚化合物十分有限，導(dǎo)致血液中無(wú)法產(chǎn)生足夠濃度的H2S，由此也解釋了直接食用大蒜對(duì)人體排鉛作用不明顯的原因。

3 結(jié)語(yǔ)

天然大蒜精油是人們?nèi)粘Ｉ钪谐Ｓ玫氖称诽砑觿?，?jīng)長(zhǎng)期研究證實(shí)其具有多項(xiàng)對(duì)人體有益的保健功能，如提高免疫力、殺菌、降血脂/膽固醇、軟化血管/防血栓、防癌等?，F(xiàn)有研究結(jié)果表明，大蒜精油進(jìn)入人體后，與GSH反應(yīng)生成H2S而實(shí)現(xiàn)優(yōu)異的排鉛效果，其作用并不亞于目前市場(chǎng)上流通的排鉛藥物。由于其作用機(jī)制不同于目前市場(chǎng)上流通的排鉛藥物，常規(guī)攝入量下無(wú)毒副效應(yīng)，因此，天然大蒜精油是大自然賜予人類的一種安全、高效的天然排鉛保健食品，對(duì)改善我國(guó)較為嚴(yán)重的鉛污染現(xiàn)狀以及降低由此引起的潛在國(guó)民智力素質(zhì)下降的危險(xiǎn)性、特別是對(duì)兒童青少年和適婚適育年齡人群降低鉛中毒風(fēng)險(xiǎn)具有重大意義。