魏亞玲， 何 娜， 柏建安， 湯琪云

1.南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，江蘇 南京 210029； 2.南京醫(yī)科大學(xué)附屬逸夫醫(yī)院消化內(nèi)科

神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤起源于人體彌散神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)，好發(fā)于消化道的胃、腸道、胰腺部位，稱為胃腸胰神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤(gastroenteropancreatic neuroendocrine neoplasms, GEP-NENs)[1-2]。近些年，GEP-NENs的發(fā)病率穩(wěn)步上升，在消化道腫瘤發(fā)病率中僅次于結(jié)腸癌居第2位[3]。GEP-NENs患者臨床表現(xiàn)常常缺乏特異性，大部分患者確診時(shí)常已處于晚期[4]。目前，GEP-NENs的具體致病機(jī)制尚不清楚，臨床上也缺乏早期診斷的有效分子標(biāo)志物[5-6]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNA)是長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸且不具備蛋白質(zhì)編碼能力的RNA分子[7]。與蛋白質(zhì)編碼基因相比，lncRNA表達(dá)的組織特異性更高，這提示，lncRNA也許能成為更有效的生物標(biāo)志物[8]。許多研究[9-11]表明，腫瘤組織中表達(dá)異常的lncRNA能參與腫瘤生物學(xué)行為的改變。本研究采用人全轉(zhuǎn)錄組芯片技術(shù)檢測(cè)胃神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤(gastric neuroendocrine neoplasms, G-NENs)組織及癌旁組織中的lncRNA表達(dá)譜差異，初步篩選出可能與GEP-NENs致病機(jī)制相關(guān)的lncRNA肝細(xì)胞核因子1 alpha反義鏈1(hepatocyte nuclear factor 1 alpha-antisense 1, HNF1A-AS1)。旨在分析HNF1A-AS1在G-NENs組織及其相應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)情況，探究GEP-NENs腫瘤細(xì)胞內(nèi)部HNF1A-AS1對(duì)于腫瘤細(xì)胞生物學(xué)功能的影響，為臨床早期診斷和治療GEP-NENs提供新的思路。

1 材料與方法

1.1材料收集南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院的3例G-NENs患者的組織樣本(由于該腫瘤發(fā)病率低，2010年至2015年我們僅收集到3例G-NENs，未獲得其他部位滿意的G-NENs組織，因此將該3例G-NENs患者均納入本研究的芯片分析中)。所有G-NENs患者術(shù)前均未接受任何局部及全身治療，術(shù)中切除標(biāo)本送病理科，部分做病理檢查，部分置于-80 ℃保存。同時(shí)取患者相應(yīng)癌周正常胃組織并經(jīng)病理證實(shí)為腫瘤陰性的作為對(duì)照。GEP-NENs腫瘤細(xì)胞系BON-1和LCC-18細(xì)胞(美國(guó)模式菌種保藏中心)；TRIzol試劑、Essential DNA Green Master(Roche公司，美國(guó))；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、G-Flex DNA聚合酶(TaKaRa公司，日本)；Lipofectamine 2000 (Life technologies公司，美國(guó))；結(jié)晶紫(碧云天，中國(guó))；Transwell(Millipore公司，美國(guó))；兔抗人β-catenin單克隆抗體、兔抗人E-cadherin單克隆抗體(Cell Signaling Technology公司，美國(guó))。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組BON-1細(xì)胞采用含質(zhì)量濃度為100 g/L的胎牛血清、100 μg/ml 青霉素/鏈霉素的DMEM/F 12培養(yǎng)基，LCC-18細(xì)胞采用含質(zhì)量濃度為100 g/L的胎牛血清、100 μg/ml 青霉素/鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。過表達(dá)HNF1A-AS1的LCC-18和BON-1細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組，轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的LCC-18和BON-1細(xì)胞作為對(duì)照組。

1.3質(zhì)粒構(gòu)建及細(xì)胞轉(zhuǎn)染用于HNF1A-AS1目的片段擴(kuò)增的引物序列如下：上游:5′-TTAGGTACCAGTAAGTGCAGTAGGTAGGCCAAGA-3′，下游:5′-TTACTCGAGGAGACGGAGTTTCGTTCTTGTTCC-3′。 采用G-Flex DNA聚合酶擴(kuò)增HNF1A-AS1 DNA 片段。PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳獲得純化，接著采用Kpn I和 Xho I對(duì)HNF1A-AS1 DNA片段進(jìn)行雙酶切。酶切產(chǎn)物定向連接至表達(dá)載體pcDNA3.1的Kpn I 和 Xho I位點(diǎn)之間，從而構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA3.1-HNF1A-AS1。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸埃希菌, 隨機(jī)挑選陽(yáng)性克隆進(jìn)行DNA測(cè)序分析，鑒定后抽提質(zhì)粒備用。將傳代的LCC-18、BON-1細(xì)胞消化接種于6孔板中，當(dāng)6孔板細(xì)胞密度為80%～90%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，更換為Opti-MEM，配制空質(zhì)粒或過表達(dá)質(zhì)粒與Lipofectamine 2000、Opti-MEM的混合轉(zhuǎn)染液，靜止20 min后加入6孔板中，轉(zhuǎn)染6 h后用完全培養(yǎng)基替換轉(zhuǎn)染液繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞。

1.4細(xì)胞活力檢測(cè)采用MTT方法檢測(cè)細(xì)胞活力。細(xì)胞以每孔5 000個(gè)的密度接種于96孔板，在細(xì)胞轉(zhuǎn)染后的不同時(shí)間點(diǎn)，每孔加入100 μl 5 mg/ml的MTT，37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中孵育4～6 h。每孔加入100 μl質(zhì)量濃度為200 g/L的SDS以溶解細(xì)胞內(nèi)部形成的甲瓚，37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中孵育20 h后于酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在570 nm波長(zhǎng)處的吸光度值(OD)。

1.5人全轉(zhuǎn)錄組芯片分析采用miRNeasy Mini試劑盒和RNase-Free Dnase Set提取并純化組織總RNA。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)Affymetrix說明書，利用GeneChip?WT PLUS Reagent 試劑盒從250 ng 總RNA中獲得生物素化的cDNA。5.5 μg cDNA在標(biāo)記后于GeneChip?Hybridization Oven 645上45 ℃雜交16 h以進(jìn)行人全轉(zhuǎn)錄組芯片分析。利用Affymetrix Fluidics Station 450對(duì)基因芯片進(jìn)行清洗和染色。最后采用GeneChip?Scanner 3000 7 G 對(duì)芯片進(jìn)行掃描。原始數(shù)據(jù)通過Robust Multiarray軟件分析并完成log2轉(zhuǎn)化。采用火山圖篩選具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異表達(dá)lncRNA[12]。本研究的篩選條件為：差異倍數(shù)>2且P<0.05。

1.6RNA提取和定量實(shí)時(shí)PCR(qRT-PCR) 采用TRIzol試劑提取組織和細(xì)胞中的總RNA。按照TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以合成的cDNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)，GAPDH作為內(nèi)參照。HNF1A-AS1上游引物:5′-TCAAGAAATGGTGGCTAT-3′，下游引物:5′-GCTCTGAGACTGGCTGAA-3′；GAPDH上游引物:5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGT-3′，下游引物:5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′；E-cadherin上游引物:5′-CGAGAGCTACACGTTCACGG-3′，下游引物:5′-GGGTGTCGAGGGAAAAATAGG-3′；β-catenin上游引物:5′-AAAGCGGCTGTTAGTCACTGG-3′，下游引物:5′-CGAGTCATTGCATACTGTCCAT-3′。

1.7細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后胰酶消化細(xì)胞，并用基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸，將200 μl含有6×104個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液加入Transwell小室上層，將500 μl含質(zhì)量濃度為100 g/L胎牛血清的完全培養(yǎng)基加入Transwell小室下層。在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。將小室置于質(zhì)量濃度為40 g/L的多聚甲醛固定30 min，質(zhì)量濃度為10 g/L的結(jié)晶紫染色15 min，取出小室并用棉簽輕輕擦拭上層未遷移細(xì)胞，拍照并計(jì)數(shù)。

1.8Westernblotting檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，收集細(xì)胞，制備SDS-PAGE樣品。Western blotting檢測(cè)LCC-18細(xì)胞內(nèi)E-cadherin、β-catenin的蛋白水平表達(dá)變化。配置10%分離膠和5%濃縮膠。等量樣品經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)移至甲醇預(yù)處理的PVDF膜上(100 V電轉(zhuǎn)2 h)。經(jīng)質(zhì)量濃度為50 g/L的脫脂牛奶封閉1 h后，一抗(1∶1 000)4 ℃孵育過夜，次日二抗(1∶5 000)室溫孵育2 h。洗滌后加入ECL底物(同體積A和B混合液)室溫1 min，最后于暗室顯影、定影。

2 結(jié)果

2.1HNF1A-AS1在G-NENs組織及其癌旁組織中表達(dá)本文采用人全轉(zhuǎn)錄組芯片技術(shù)獲得3例G-NENs組織及其相應(yīng)癌旁組織的差異lncRNA表達(dá)譜。從中篩選差異倍數(shù)>2且P<0.05的35個(gè)lncRNA作為候選lncRNA。而HNF1A-AS1是這些候選lncRNA中的一員，其在G-NENs組織中的表達(dá)水平明顯低于癌旁組織(平均差異倍數(shù)=2.07，P<0.05，見圖1A)。利用qRT-PCR進(jìn)一步驗(yàn)證芯片結(jié)果的可靠性，結(jié)果顯示，與癌旁組織比較，3例G-NENs組織中HNF1A-AS1的表達(dá)水平均明顯下降，兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001，見圖1B)。

注：與癌旁組織比較，*P<0.001。

2.2pcDNA3.1-HNF1A-AS1質(zhì)粒過表達(dá)效率檢測(cè)

pcDNA3.1-HNF1A-AS1過表達(dá)質(zhì)粒和pcDNA3.1空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞系LCC-18和BON-1細(xì)胞后，過表達(dá)組的HNF1A-AS1相對(duì)表達(dá)量均明顯高于轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組，兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001，見圖2)。

2.3過表達(dá)HNF1A-AS1對(duì)GEP-NENs細(xì)胞增殖的影響與空質(zhì)粒組相比，LCC-18細(xì)胞轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-HNF1A-AS1過表達(dá)質(zhì)粒后，OD值明顯下降(P<0.05，見圖3A)。BON-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-HNF1A-AS1過表達(dá)質(zhì)粒后，OD值也明顯低于空質(zhì)粒組(P<0.01，見圖3B)。

2.4過表達(dá)HNF1A-AS1對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響與空質(zhì)粒組相比，過表達(dá)HNF1A-AS1后，LCC-18和BON-1細(xì)胞遷移到Transwell小室下層的數(shù)目均明顯減少，兩組之間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001，見圖4)。

注：與空質(zhì)粒組比較，*P<0.001。

2.5過表達(dá)HNF1A-AS1對(duì)細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymaltransition,EMT)標(biāo)志物的影響

與空質(zhì)粒組相比，LCC-18細(xì)胞過表達(dá)HNF1A-AS1后，間葉細(xì)胞標(biāo)志物β-catenin 的RNA及蛋白表達(dá)水平明顯下降(P<0.05，見圖5)，而上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin的RNA及蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.01，見圖5)。

3 討論

近年來，GEP-NENs發(fā)病率明顯升高，但其早期診斷、治療效果仍不理想，因此對(duì)其發(fā)病機(jī)制的研究顯得尤為重要。受益于日漸成熟的全基因組測(cè)序和轉(zhuǎn)錄本分析技術(shù)，發(fā)現(xiàn)約66%的人類基因能積極地轉(zhuǎn)錄成為RNA，但僅有1%～2%的基因具有蛋白質(zhì)編碼能力[13]。占絕大多數(shù)的非編碼RNA分子，尤其是lncRNA分子在諸如細(xì)胞分化、增殖和凋亡等生物過程中發(fā)揮重要作用[14]。研究[9]表明，人類腫瘤細(xì)胞的存活和轉(zhuǎn)移與腫瘤組織當(dāng)中異常的lncRNA水平明顯相關(guān)。

注：與空質(zhì)粒組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

注：與空質(zhì)粒組比較，*P<0.001。

注：與空質(zhì)粒組比較，*P<0.05，**P<0.01。

目前為止，lncRNA在GEP-NENs中的作用仍未見報(bào)道。本研究采用人全轉(zhuǎn)錄組芯片技術(shù)檢測(cè)G-NENs組織及其癌旁組織中差異表達(dá)的lncRNA，通過初步篩選獲得可能與GEP-NENs致病機(jī)制有關(guān)的lncRNA HNF1A-AS1。HNF1A-AS1是一個(gè)長(zhǎng)度為2 455個(gè)核苷酸的轉(zhuǎn)錄本，其基因位于第12號(hào)染色體[15]。之前已有多篇文獻(xiàn)報(bào)道HNF1A-AS1參與人類腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。YANG等[15]發(fā)現(xiàn)，HNF1A-AS1可以參與調(diào)控食管癌細(xì)胞的增殖、細(xì)胞周期進(jìn)展、遷移與侵襲等過程而發(fā)揮腫瘤促進(jìn)作用。但另一些研究[16-17]卻發(fā)現(xiàn)，HNF1A-AS1在胃癌組織與胰腺癌組織中表達(dá)明顯下降，這與我們的芯片結(jié)果相一致，提示HNF1A-AS1可能是GEP-NENs的潛在致病機(jī)制。

本研究發(fā)現(xiàn)，與癌旁組織相比，G-NENs組織中HNF1A-AS1顯著低表達(dá)。體外實(shí)驗(yàn)表明，GEP-NENs細(xì)胞過表達(dá)HNF1A-AS1后，腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移能力受到明顯抑制。此外，上調(diào)HNF1A-AS1表達(dá)之后，GEP-NENs細(xì)胞的上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)升高，而間葉細(xì)胞標(biāo)志物β-catenin表達(dá)下降，這提示HNF1A-AS1能夠抑制GEP-NENs發(fā)生EMT。

然而本研究仍存在一定局限性。首先，我們后續(xù)應(yīng)收集更多臨床樣本，特別是在人腸道和胰腺部位的神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤組織中進(jìn)行HNF1A-AS1的組織水平驗(yàn)證，并進(jìn)一步分析HNF1A-AS1表達(dá)水平與GEP-NENs患者臨床病理特征之間的關(guān)系；其次，雖然本研究首次探究了HNF1A-AS1對(duì)GEP-NENs細(xì)胞增殖、遷移的影響，但并未涉及HNF1A-AS1與細(xì)胞周期、凋亡等之間的關(guān)系，且尚未利用裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)進(jìn)行體內(nèi)驗(yàn)證。

綜上所述，HNF1A-AS1在GEP-NENs組織中表達(dá)下調(diào)，推測(cè)HNF1A-AS1與GEP-NENs的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，有可能成為GEP-NENs的診斷新指標(biāo)和治療的新靶點(diǎn)。然而，HNF1A-AS1在GEP-NENs發(fā)病中的具體作用機(jī)制還不明確，仍待進(jìn)一步研究。