呂婷婷， 楊 雷， 沈 磊

武漢大學(xué)人民醫(yī)院消化內(nèi)科 消化系統(tǒng)疾病湖北省重點實驗室，湖北 武漢 430060

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease, IBD)是指一組病因不明的慢性非特異性腸道炎癥性疾病，包括潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)和克羅恩病(Crohn’s disease，CD)。近50年來，隨著人民生活水平改善和臨床診斷水平的提高，UC的發(fā)病率持續(xù)增長，從(8～14)/10萬增加到(120～200)/10萬，CD發(fā)病率從(6～15)/10萬增加到(50～200)/10萬[1]?；⒄溶兆鳛橐环N植物多酚類藥物，具有較強的抗炎、抗氧化藥理學(xué)作用[2]，有研究[3]表明，虎杖苷能夠通過上調(diào)Hedgehog信號通路來發(fā)揮抗炎、抗氧化、抗凋亡作用。目前尚無實驗研究虎杖苷在小鼠急性UC中對Hedgehog信號通路的影響，本課題擬探討虎杖苷對葡聚糖硫酸鈉(dextran sodium sulfate, DSS)誘導(dǎo)的UC的作用及其對小鼠結(jié)腸組織中Hedgehog通路的影響。

1 材料與方法

1.1實驗材料雄性C57BL/6J小鼠30只，SPF環(huán)境下飼養(yǎng)，6～8周齡，體質(zhì)量為(22±2)g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。DSS相對分子質(zhì)量為35 000～50 000，購自美國MP公司?；⒄溶?純度≥98%)購自北京百靈威科技有限公司。PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Sigma公司，抗Gli1蛋白一抗購自美國艾博抗有限公司。

1.2實驗分組30只小鼠采用隨機數(shù)字表法分成空白組、模型組、虎杖苷低、中、高干預(yù)組(15 mg/kg、30 mg/kg、45 mg/kg)，每組6只，SPF環(huán)境下飼養(yǎng)。造模：模型組及藥物干預(yù)組小鼠每天自由飲用質(zhì)量濃度為30 g/L的DSS溶液，空白組小鼠每天予正常飲水。藥物干預(yù)：空白組正常飲水同時予質(zhì)量濃度為9 g/L的生理鹽水，腹腔注射7 d；模型組造模同時予含質(zhì)量濃度為9 g/L生理鹽水，腹腔注射7 d；藥物干預(yù)組造模同時分別予虎杖苷 15 mg/kg、30 mg/kg、45 mg/kg,腹腔注射7 d。

1.3疾病活動度評分每天記錄每組小鼠體質(zhì)量、大便性狀及便血情況，計算疾病活動指數(shù)(disease activity index，DAI)評分(見表1)。

表1 疾病活動度評分Tab 1 Disease activity index score

1.4取材實驗7 d后小鼠頸椎脫臼處死，迅速解剖，取小鼠全部結(jié)直腸及回盲部，測量結(jié)腸長度；取病變明顯處結(jié)腸組織標本(約5 mm×10 mm)，質(zhì)量濃度為40 g/L的多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片后進行HE染色，剩余結(jié)腸組織凍存于-80 ℃冰箱備用。

1.5組織病理學(xué)評分通過HE染色切片觀察結(jié)腸黏膜形態(tài)。參照Cooper等的組織學(xué)評分標準(見表2)。

表2 病理組織評分Tab 2 The histological tissues score

1.6結(jié)腸炎性因子RT-PCR檢測取-80 ℃冰箱中保存的結(jié)腸組織，重量約為100 mg，加入Trizol試劑，用勻漿器研磨成漿，移至無RNase的EP管中裂解。加入氯仿，劇烈顛倒混勻數(shù)次，室溫放置5 min，離心15 min，轉(zhuǎn)移上層水相于另一新EP管中，加入異丙醇，混勻后室溫靜置10 min。離心10 min，管底可見白色的RNA沉淀。棄上清，加入無RNase的質(zhì)量濃度為750 g/L的乙醇1 ml，渦旋混勻后，離心5 min。棄上清，空氣中干燥RNA沉淀5～10 min，將沉淀溶于20 μl DEPC水中。取溶解后的RNA 2 μl用微量分光光度計測定RNA的純度和濃度。在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系中將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，cDNA 10倍稀釋，實時熒光定量RT-PCR檢測，繪制溶解曲線，引物序列見表3。

1.7結(jié)腸組織細胞核內(nèi)Gli1蛋白表達檢測Western blotting檢測結(jié)腸組織細胞核內(nèi)Gli1表達水平。取留存的結(jié)腸組織勻漿離心制成細胞裂解液，而后進行SDS-PAGE，采用硝酸纖維膜轉(zhuǎn)膜，再用質(zhì)量濃度為50 g/L的封閉液(質(zhì)量濃度為50 g/L的脫脂奶粉的TBST)封閉1 h，以TBST洗滌3次，每次洗滌5 min。用加入含一抗Gli1和β-actin封閉液室溫孵育過夜，TBST洗滌3次，每次洗滌5 min。加辣根過氧化物酶耦聯(lián)的二抗(1∶10 000稀釋)，室溫作用1 h，TBST洗滌3次，每次洗滌5 min，以顯色液顯色。顯色后攝片，采用計算機圖像軟件進行灰度分析，測定灰度值。

表3 引物設(shè)計Tab 3 PCR primers

2 結(jié)果

2.1DAI評分造模過程中，空白組小鼠體質(zhì)量均無降低，無潛血陽性，模型組小鼠體質(zhì)量下降明顯，在2～3 d開始出現(xiàn)潛血試驗陽性，3～4 d開始出現(xiàn)便血，并逐漸加重，DAI評分較高；藥物干預(yù)組體質(zhì)量、便血情況較模型組程度輕(P<0.05)(見圖1A)。

2.2結(jié)腸長度改變與空白組比較，模型組小鼠結(jié)腸長度明顯縮短(P<0.05)；與模型組比較，虎杖苷治療中、高劑量干預(yù)組結(jié)腸長度均顯著變長(P<0.05);(見圖1B～1C),低劑量組結(jié)腸長度無顯著變化(P>0.05)。

2.3小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)評分模型組小鼠結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)不完整，腸絨毛變薄，黏膜及黏膜下層出現(xiàn)大量炎性細胞浸潤，周圍腺體排列紊亂，上皮及隱窩破壞明顯；虎杖苷低、中、高劑量干預(yù)組小鼠結(jié)腸黏膜及腸絨毛結(jié)構(gòu)較模型組破壞輕，結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)大致完整。病理組織學(xué)評分顯示：與空白組比較，模型組評分顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，虎杖苷低、中、高劑量干預(yù)組評分均顯著降低(P<0.05)(見圖2)。

注：與DSS組比較，*P<0.05，**P<0.01。

注：與DSS組比較，*P<0.05,**P<0.01。

2.4小鼠結(jié)腸炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-23、IL-17表達與空白組比較，模型組結(jié)腸組織中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-23、IL-17含量顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，虎杖苷中、高劑量干預(yù)組結(jié)腸組織中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-23、IL-17含量顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),低劑量組與模型組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(見圖3)。

注：與DSS組比較，*P<0.05,**P<0.01。

2.5小鼠結(jié)腸組織內(nèi)的Hedgehog信號通路的改變

Hedgehog信號通路下游直接轉(zhuǎn)錄因子Gli1改變,與空白組比較，模型組結(jié)腸組織Gli1 mRNA水平及蛋白水平顯著降低(P<0.01)；與模型組比較，虎杖苷中、高劑量組結(jié)腸組織細胞中Gli1 mRNA水平和蛋白水平明顯升高(P<0.01),低劑量組無顯著變化(P>0.05)(見圖3～4)。

注：與DSS組比較，*P<0.05,**P<0.01。

3 討論

在臨床上IBD藥物治療主要包括氨基水楊酸制劑、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑和抗TNF-α生物制劑等[4]，近年來研究證實，中藥制劑對IBD也有較好的治療作用，并可長期服用。虎杖苷(3,4,5-三羥基-3-β-D-單葡萄糖苷)是從中藥虎杖的根莖中提取的第4種單體,是白藜蘆醇與葡萄糖的結(jié)合物，具有抗炎、抗氧化、抗凋亡和改善微循環(huán)、保護線粒體功能等藥理學(xué)作用[2]。本實驗通過對我國中藥虎杖苷在IBD中療效及機制的研究，為虎杖苷在IBD中的治療作用提供科學(xué)的理論基礎(chǔ)。

TNF-α、IL-1β、IL-6作為腸道炎癥反應(yīng)中的主要促炎因子，其激活能引起腸道炎癥的級聯(lián)放大反應(yīng)，導(dǎo)致機體的局部炎癥和免疫系統(tǒng)紊亂[5-6]。在腸道炎癥自我平衡中，來自于固有免疫細胞系促炎細胞因子(例如IL-1β、 IL-6、IL-23)和效應(yīng)T細胞系(例如Th1和Th17)的促炎細胞因子常維持在穩(wěn)定的平衡中，而在IBD患者腸道內(nèi)，該平衡往往被打破，固有免疫細胞和效應(yīng)T細胞常常產(chǎn)生大量的促炎細胞因子。抗原提呈細胞產(chǎn)生IL-23與Th17細胞的分化、擴增和穩(wěn)定密切相關(guān)，固有CD4+Th17細胞能夠在TGF-β、IL-6和IL-1β環(huán)境下誘導(dǎo)IL-23受體的表達，IL-23作用于該受體激活Th17細胞的分化并分泌包括IL-17在內(nèi)的促炎因子[7]，IL-23/IL-17不僅參與腸道微生物的防御[8]，在多種IBD模型中，如CD4+CD45RBhi 轉(zhuǎn)移模型、IL-10-/-結(jié)腸炎模型中，DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎模型和TNBS誘導(dǎo)結(jié)腸炎模型中均高表達，而抗IL-23治療能夠預(yù)防并治療結(jié)腸炎癥狀[9]。在通過虎杖苷干預(yù)DSS誘導(dǎo)的急性UC小鼠后，其癥狀較模型組明顯減輕，且腸道的炎癥反應(yīng)明顯低于模型組。與DSS誘導(dǎo)的模型組相比，虎杖苷干預(yù)組的小鼠DAI評分顯著降低，結(jié)腸縮短程度降低，結(jié)腸組織病理學(xué)評分顯著降低，RT-PCR檢測結(jié)腸組織炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-23、IL-17明顯降低，對腸道炎癥反應(yīng)有明顯的改善作用，對小鼠急性UC有治療作用。虎杖苷通過降低結(jié)腸組織內(nèi)固有免疫細胞系的促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6的水平和效應(yīng)T細胞系IL-23/IL-17促炎信號而發(fā)揮明顯的抗炎作用，明顯緩解小鼠結(jié)腸炎癥狀。

Hedgehog信號通路作為胃腸道的胚胎發(fā)育過程中重要部分，其主要參與哺乳動物早期胃腸道器官的發(fā)育和形成，能夠保證消化道正常的軸向分化方向，近年來，越來越多的證據(jù)表明，Hedgehog信號通路參與成人急性上皮損傷和腸道慢性炎癥反應(yīng)[10]，并與IBD的發(fā)病有很大的關(guān)聯(lián)，該通路在成人的結(jié)腸中主要靶細胞為樹突狀細胞和巨噬細胞[11]，降低50% Hh信號通路能夠?qū)е伦园l(fā)結(jié)腸炎的發(fā)生，通過沉默Gli1+/-基因引起Hedgehog信號通路下調(diào)，可導(dǎo)致小鼠對DSS誘導(dǎo)的UC易感性增加，其機制可能是由于該通路明顯上調(diào)IL-23/IL-17信號，同時促進腸道主要的炎性因子，如IL-1β、IL-6和一些CC、CXC型細胞因子的表達[12]。在多種動物模型中均表明虎杖苷可通過Hedgehog信號通路來發(fā)揮抗炎、抗氧化和抗凋亡的作用，本實驗進一步探討在急性UC小鼠中虎杖苷抗炎作用與Hedgehog信號通路的關(guān)系。細胞核內(nèi)Gli1作為Hedgehog信號通路的直接轉(zhuǎn)錄因子，其表達水平可直接反映該通路的活化水平，在經(jīng)虎杖苷藥物干預(yù)后，與模型組相比，結(jié)腸組織細胞核的Gli1蛋白水平明顯升高，說明虎杖苷可能通過上調(diào)Hedgehog信號通路水平來發(fā)揮抗炎作用，Hedgehog信號通路的激活可通過固有免疫和適應(yīng)性免疫進一步降低TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-23/IL-17促炎信號。

本研究表明，虎杖苷對DSS誘導(dǎo)的急性UC有較好的治療作用，其抗炎作用可能與上調(diào)Hedgehog信號通路有關(guān)，這不僅研究了虎杖苷對IBD的治療作用，也對治療機制提供了理論基礎(chǔ)。