馬怡暉， 王青杰， 黃 培， 高漢青， 王 豐， 李珊珊

鄭州大學第一附屬醫(yī)院病理科，河南 鄭州 450052

胃腺癌是我國消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率僅次于肺癌，位居第2位。很多患者確診時已處于中晚期，且常伴有轉(zhuǎn)移，預后差，5年生存率低。CD44作為細胞表面的組成成分，在許多實體腫瘤干細胞中表達，現(xiàn)認為它是多種腫瘤干細胞的標記物。表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)屬于酪氨酸激酶Ⅰ型受體家族成員之一，參與和調(diào)控細胞的多種生理功能等，一旦其被激活或者異常表達，就會促進腫瘤細胞增殖、黏附、侵襲和轉(zhuǎn)移。本研究應用免疫組化方法檢測163例胃腺癌組織中CD44和EGFR的表達及相關性，探討其表達與胃腺癌臨床病理特征的關系，以期為胃腺癌的診斷和判斷預后提供一種理想的腫瘤標記物。

1 資料與方法

1.1一般資料收集2015年1月至2016年12月鄭州大學第一附屬醫(yī)院外科胃腺癌根治術后的163例進展期胃腺癌組織石蠟標本，并選取同期20例遠端(距腫瘤5 cm以上)黏膜組織作為陰性對照，全部患者術前均未行任何輔助治療(化療、放療及靶向治療)。對所有病例的組織病理切片進行復閱。163例胃腺癌患者中，男133例，女30例。年齡28～86歲，中位年齡63歲。腫瘤最大直徑0.2～13 cm，平均4.7 cm。Lauren病理分型：腸型81例，彌漫型57例，混合型25例。按照2010版WHO標準劃分[1]，高分化6例，中分化96例，低分化61例。淋巴結轉(zhuǎn)移91例，無轉(zhuǎn)移72例，有遠處臟器轉(zhuǎn)移10例。參照美國癌癥聯(lián)合委員會(American Joint Committee on Cancer, AJCC)病理學分期(pathological TNM classification，pTNM)，Ⅰ期15例，Ⅱ期76例，Ⅲ期62例，Ⅳ期10例。

1.2方法所有標本均經(jīng)質(zhì)量濃度為100 g/L中性甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，厚4 μm切片，除作常規(guī)HE染色外，余作免疫組織化學染色。采用免疫組織化學SP法進行檢測，CD44和EGFR抗體均為即用型，購自北京中杉金橋生物技術有限公司。以PBS代替一抗作陰性對照，并按照試劑說明書提供陽性標本作陽性對照。

1.3免疫組織化學結果判斷標準鏡下觀察，對細胞膜及細胞核出現(xiàn)棕黃色或棕色顆粒的細胞作為陽性細胞進行分析；CD44和EGFR的陽性物質(zhì)定位于細胞膜，對染色結果進行半定量分析[2]，根據(jù)整張切片中陽性腫瘤細胞占全部腫瘤細胞的比例定為：(-)陽性細胞數(shù) <10%，(+)陽性細胞數(shù)10%～25%，(++)陽性細胞數(shù)26%～50%，(+++)陽性細胞數(shù)>50%。將CD44和EGFR(-)歸為表達陰性，(+)～(+++)歸為陽性。

1.4統(tǒng)計學分析采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學分析，采用例數(shù)/%進行統(tǒng)計描述，組間差異采用χ2檢驗，兩指標相關性采用Spearman相關分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1CD44和EGFR在胃腺癌和正常胃黏膜中的表達CD44蛋白主要細胞膜表達，部分伴細胞質(zhì)表達在彌漫型胃腺癌中高表達。163例胃腺癌標本中，CD44陽性表達率為63.2%(103/163)，而在20例正常胃黏膜組織中陽性率為5.0%(1/20)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(見圖1～2)。EGFR陽性標記定位于細胞膜，呈黃棕色顆粒。EGFR在胃腺癌中陽性表達率為38.7%(63/163)，而在正常胃黏膜組織中陽性率為15.0%(3/20)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(見圖3～4)。

圖1 CD44陽性定位于腫瘤細胞膜，少部分位于細胞質(zhì)，其在彌漫型胃腺癌中高表達(100×)；圖2 CD44在正常胃黏膜腺

Fig1ThepositiveexpressionofCD44wasmostlylocatedinthemembraneofthetumorcellswithafewpartsinthecytoplasm,anditwashighlyexpressedinthegastricadenocarcinomaofdiffusetype(100×);Fig2CD44wasnegativeinthenormalgastricmucosaepithelium(200×);Fig3ThepositiveexpressionofEGRFwaslocatedinthemembraneofthetumorcells,anditwashighlyexpressedinthemiddletolowdifferentiatedgastricadenocarcinoma(100×);Fig4EGFRwasnegativeinthenormalgastricmucosaepithelium(200×)

2.2CD44和EGFR的表達與臨床病理特征的關系

CD44的表達與胃腺癌的分化程度、Lauren分型、淋巴結轉(zhuǎn)移及臨床分期有顯著相關性(P均<0.05)，其在分化較差、Lauren分型彌漫型、伴淋巴結轉(zhuǎn)移及較高臨床分期(Ⅲ和Ⅳ期)的胃腺癌中，表達顯著高于其他組。EGFR的表達與Lauren分型及淋巴結轉(zhuǎn)移顯著相關(P均<0.05)，其在Lauren分型彌漫型和伴淋巴結轉(zhuǎn)移的胃腺癌中表達明顯高于其他各組(見表1)。

2.3CD44和EGFR表達相關性分析CD44與EGFR均為陽性者49例，均為陰性者46例，CD44陽性而EGFR陰性54例，EGFR陽性而CD44陰性14例，兩者表達有相關性(r=0.233，P=0.002)。

表1 CD44和EGFR的表達與臨床病理參數(shù)相關性Tab 1 Expressions of CD44 and EGFR and their relationship with the clinical pathological characters

3 討論

近年來，盡管胃腺癌的診療技術不斷發(fā)展，但很多患者在確診時已處于中晚期且常伴有轉(zhuǎn)移。因此，尋找有效的預測預后相關分子標記物顯得十分重要。人類CD44基因位于11號染色體短臂上，有20個高度保守的外顯子，每個外顯子長度從70 bp到210 bp不等，是一種跨膜糖蛋白，屬于黏附分子家族[3]。CD44分子家族按照含有CD44基因中所含外顯子類型不同分類，分為標準型CD44(CD44s)和變異型CD44(CD44v)。許多正常細胞表面CD44處于相對靜止狀態(tài)，而腫瘤細胞表面CD44處于活化狀態(tài)，能與其主要配體透明質(zhì)酸結合，通過直接途徑和替代途徑增強整合素介導的細胞與細胞、細胞與細胞基質(zhì)間的相互作用，參與腫瘤細胞生長、分化、遷移等過程，在多種腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移中起到重要作用，如口腔癌、肺癌、大腸癌、肝癌、胃腺癌等[4-8]。在對胃腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，CD44可能在胃腺癌干細胞參與的腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移機制中發(fā)揮重要作用，并與胃腺癌的發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移、耐藥及復發(fā)有著密切關系[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，CD44在分化較差的胃腺癌組織中過表達，而在正常胃黏膜組織中幾乎無表達，與文獻報道一致；而且CD44的過表達與胃腺癌淋巴結轉(zhuǎn)移及較高的臨床分期相關，說明CD44蛋白的表達參與到胃腺癌浸潤和淋巴結轉(zhuǎn)移的過程中，一定程度上提示其與胃腺癌的預后相關。因此，通過檢測胃腺癌組織CD44蛋白表達情況，可以更好地對腫瘤的復發(fā)和轉(zhuǎn)移等予以較為客觀的判斷，更好地指導臨床治療。

EGFR共包括HER1、HER2、HER3和HER4，在其家族成員中，HER1、HER2是近年來被廣泛關注和研究的胃腺癌分子靶點。EGFR是一種可與特定配體結合的細胞膜受體，如果其胞內(nèi)酪氨酸激酶結合域被活化，下游信號傳導通路相繼被激活，進一步導致DNA的合成和細胞分裂增殖。EGFR分布于器官組織中，其生物學功能包括促進惡性腫瘤細胞分裂增殖，血管生成、黏附、侵襲和轉(zhuǎn)移，抑制腫瘤細胞凋亡的作用。有研究發(fā)現(xiàn)，EGFR在腫瘤中過表達，提示患者存活率低、預后差、轉(zhuǎn)移可能性大[10-11]；且EGFR蛋白在各種消化道腫瘤中的發(fā)生、發(fā)展及癌細胞轉(zhuǎn)移過程都有作用，尤其在胃腺癌組織中，隨著胃黏膜病變由良性轉(zhuǎn)為惡性，即從胃炎、腸化生到異常增生、胃腺癌的過程中，EGFR表達不斷增加，說明EGFR參與了胃腺癌的發(fā)生、發(fā)展[12]。本研究結果顯示，EGFR的表達與胃腺癌的Lauren分型及淋巴結轉(zhuǎn)移顯著相關，說明EGFR隨著胃腺癌的分化及淋巴結發(fā)生轉(zhuǎn)移表達增加。我們認為，通過評判胃腺癌中EGFR的表達水平，臨床可制定相應的治療方案，改善患者預后。目前以EGFR為靶點的分子治療已經(jīng)有了長足的發(fā)展，但在胃腺癌中的應用還不是很成熟，相信隨著分子病理學的發(fā)展以EGFR開發(fā)的藥物可能會影響胃腺癌患者的治療效果。

本研究進一步的相關分析顯示，在胃腺癌中CD44的陽性表達與EGFR顯著相關。以往研究報道，頭頸部鱗狀細胞癌中，下調(diào)CD44能夠抑制持續(xù)性的EGFR磷酸化，進而抑制癌細胞的生長[13]。乳腺癌中，EGFR激活也能夠誘導CD44的表達[14]。非小細胞肺癌中，應用EGFR抑制劑厄洛替尼能夠降低癌細胞CD44的表達[15]。多項研究應用免疫共沉淀的方法證實，EGFR與CD44在細胞內(nèi)能夠形成大分子復合物[16]。本研究與上述實驗結果一致，提示胃腺癌中CD44應該和EGFR之間也有相關性，EGFR可能通過干擾下游FAK、RAS、MAPK的信號傳導，影響CD44的表達，二者的相互關聯(lián)在胃腺癌的進展及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用，該機制有待進一步深入探討。

綜上所述，CD44和EGFR在胃腺癌的進展及轉(zhuǎn)移等過程中發(fā)揮著重要作用，聯(lián)合檢測二者有助于更好地評估胃腺癌的生物學行為，為患者的進一步治療及臨床處理提供依據(jù)。