劉曉嵐， 田兆豐， 李永丹

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，北京 100193； 2.北京市農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)環(huán)境保護(hù)研究所，北京 100097)

桃蚜屬半翅目蚜科，別稱煙蚜，是世界上分布廣泛且危害嚴(yán)重的農(nóng)作物和園藝害蟲，在我國各地均有發(fā)生[1-2]。桃蚜寄主范圍廣泛，繁殖周期短，且具有遷飛習(xí)性，短期內(nèi)種群擴(kuò)增速度快，控制難度較大?；瘜W(xué)防治一直是主要控制手段，不可避免地對常用及不合理使用的藥劑產(chǎn)生抗藥和耐藥性[3-5]。

抗蚜威屬于氨基甲酸酯類殺蟲劑，是田間防治桃蚜常用的殺蟲劑，其作用靶標(biāo)為昆蟲乙酰膽堿酯酶(AChE)[6-8]。乙酰膽堿酯酶在昆蟲神經(jīng)傳導(dǎo)過程中水解神經(jīng)遞質(zhì)——乙酰膽堿，從而終止神經(jīng)沖動傳導(dǎo)。氨基甲酸酯類農(nóng)藥降低或阻止乙酰膽堿酯酶的正常水解作用，導(dǎo)致神經(jīng)沖動傳導(dǎo)無法終止，而使昆蟲死亡[9-13]。乙酰膽堿酯酶發(fā)生變構(gòu)，對氨基甲酸酯類殺蟲劑不敏感，是桃蚜對抗蚜威產(chǎn)生抗性的重要原因[14-19]。

本研究對2015年、2016年我國河北、遼寧、江蘇、青海等多個(gè)地區(qū)桃蚜種群對抗蚜威的抗性進(jìn)行監(jiān)測，并測定乙酰膽堿酯酶的殘存活性和對抗蚜威的敏感度，明確各地桃蚜對抗蚜威的抗性發(fā)展水平，以及目前我國各地桃蚜種群乙酰膽堿酯酶變異情況，為進(jìn)一步了解桃蚜對抗蚜威的抗性機(jī)制，延緩其抗性發(fā)展速度，指導(dǎo)抗蚜威田間施藥和抗性桃蚜的抗性治理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx的采集及飼養(yǎng)

供試桃蚜種群分別于2015年與2016年5月至11月采自我國河北、遼寧、江蘇、青海等多個(gè)地區(qū)的田間或溫室，采用蛭石培育的蘿卜苗飼養(yǎng)，溫度為23～25 ℃，相對濕度為60%，光—暗周期為16 h—8 h，均一化飼養(yǎng)1代以上用于生物測定。

敏感種群：2014年采自河北定州大岳鎮(zhèn)溫室菜田，實(shí)驗(yàn)室針對抗蚜威反選育30代以上，LC50為98.17 mg/L。

1.2 供試藥劑與儀器

主要藥劑有95%抗蚜威粉劑，購自無錫瑞澤化工有限公司；化學(xué)試劑及酶標(biāo)板等，均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司和Sigma公司；主要儀器有5417C/R型臺式高速冷凍離心機(jī)、YKH-I型液體快速混合器、SPECTRA max PLUS384酶標(biāo)儀。

1.3 生物測定方法

采用葉片藥膜法，采用Moores等的方法[16]。用含有0.05% Triton X-100的蒸餾水，將用丙酮配制的原藥母液稀釋成一系列梯度濃度，以含有0.05% Triton X-100的蒸餾水作為對照。將新鮮潔凈的甘藍(lán)葉片打成直徑為3 cm的葉片碟，在稀釋好的藥液中浸15 s后取出，晾干后將葉片碟放入底部鋪有1 mL 1%瓊脂凝膠的12孔酶標(biāo)板中。用軟毛筆接入無翅成蚜，每孔接20頭成蚜，每個(gè)濃度3次重復(fù)，每個(gè)設(shè)定生物測定6～7個(gè)濃度，接好蟲的酶標(biāo)板頂部用薄宣紙封口，置于溫度為 23～25 ℃、相對濕度為60%、光—暗周期為 16 h—8 h 恒溫箱內(nèi)，24 h后檢查死亡率，用軟毛筆輕輕碰觸蟲體，足不動視為死亡。

1.4 敏感種群抗蚜威抑制乙酰膽堿酯酶曲線及抗蚜威抑制濃度的確定

采用實(shí)驗(yàn)室反選30代以上的敏感種群進(jìn)行抗蚜威抑制曲線的測定。選取120頭健康無翅成蚜，加入2 mL濃度為0.04 mol/L、pH值為7.0的磷酸緩沖液(含0.1%Triton X-100)，用勻漿器冰浴勻漿，10 800g、4 ℃條件下離心15 min，吸取上清用磷酸緩沖液稀釋至24 mL。

抗蚜威濃度梯度為1.0、2.5、5.0、10.0、25.0、50.0 μmol/L。加50 μL酶液到96孔酶標(biāo)板中，將50 μL各濃度抗蚜威、50 μL底物ATChI(碘化硫代乙酰膽堿)、100 μL顯色劑5，5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)[5，5′-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)，簡稱DTNB]混合均勻后加入到對應(yīng)的有酶液的孔中，輕輕混勻。將上述反應(yīng)體系置于酶標(biāo)儀上，于 405 nm 波長下動力學(xué)模式讀數(shù)15 min，測得反應(yīng)殘存活性，根據(jù)殘存活性百分率幾率值及抑制濃度對數(shù)值獲得抑制曲線。計(jì)算IC90，作為本試驗(yàn)敏感度測定的抑制劑濃度(診斷劑量)。

1.5 乙酰膽堿酯酶動力學(xué)測定及抗蚜威抑制乙酰膽堿酯酶動力學(xué)測定

參照Moores等的方法[16，20]并略作修改，采用酶標(biāo)儀動力學(xué)測定方法檢測單頭桃蚜動力學(xué)活性。將單頭無翅成蚜置于1.5 mL離心管中，加入200 μL 0.04 mol/L、pH值=7.0的磷酸緩沖液(含0.1% Triton X-100)，冰浴勻漿，在4 ℃、10 800g條件下離心15 min，取上清為酶液，每份50 μL，重復(fù)3次。

乙酰膽堿酯酶動力學(xué)測定：取50 μL酶液，加到冰浴的96孔酶標(biāo)板中，加入事先混勻的底物50 μL ATChI、100 μL顯色劑DTNB、50 μL緩沖液，其中ATChI終濃度為0.5 mmol/L，DTNB終濃度為15 μmol/L，酶標(biāo)儀在波長為405 nm下，每 20 s 讀數(shù)1次，讀數(shù)時(shí)間為10 min，單位時(shí)間內(nèi)D405 nm變化即為乙酰膽堿酯酶活性[10-3ΔD405 nm/(min·頭)]。每個(gè)種群檢測100頭左右。

抗蚜威抑制乙酰膽堿酯酶動力學(xué)測定：取50 μL酶液，加到冰浴的96孔酶標(biāo)板中，隨后加入事先混勻的50 μL底物ATChI、100 μL顯色劑DTNB、50 μL抑制劑(抗蚜威稀釋液)，對照以50 μL磷酸緩沖液代替，其中ATChI終濃度為 0.5 mmol/L，DTNB終濃度為15 μmol/L，抗蚜威終濃度為 67.79 μmol/L(抑制濃度的確定采用“2.2”節(jié)方法)，酶標(biāo)儀在波長405 nm下，每20 s讀數(shù)1次，讀數(shù)時(shí)間為10 min，每個(gè)種群檢測100頭左右。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

生物測定數(shù)據(jù)均采用數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件POLO進(jìn)行分析。乙酰膽堿酯酶動力學(xué)活性分析、敏感度分析與生物測定相關(guān)性分析及作圖采用SigmaPlot 10.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 各地區(qū)桃蚜抗蚜威的生物測定結(jié)果

采用葉片藥膜法對我國各地采集的桃蚜田間種群進(jìn)行抗蚜威的敏感度測定，并以敏感種群(LC50為98.17 mg/L)為對照，對比各種群抗性倍數(shù)，抗性水平的確定根據(jù)沈晉良等制定的標(biāo)準(zhǔn)[21]來判斷，試驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 2015年我國各地區(qū)桃蚜抗蚜威敏感度比較

注：抗性倍數(shù)=各供試種群LC50/敏感種群LC50。表2同。

2015年采集于各地的桃蚜種群對抗蚜威抗性存在明顯差異。其中，河北寬城種群敏感度最高，LC50為76.37 mg/L，甚至低于筆者所在實(shí)驗(yàn)室篩選的敏感品系(抗蚜威LC50為 98.17 mg/L)。河北寬城、河北深澤、上海青浦、遼寧大連種群對抗蚜威的抗性倍數(shù)低于5，對抗蚜威處于敏感階段。江蘇鹽城種群處于低抗水平(5<抗性倍數(shù)<10)，河北廊坊、江蘇宜興、江蘇吳中、江蘇大豐、青海種群處于中等抗性水平(10<抗性倍數(shù)<40)，河北唐山、上海寶山、上海崇明、遼寧綏中、江蘇高郵種群處于高抗水平(抗性倍數(shù)>40)，尤其是上海寶山與遼寧綏中LC50均明顯高于10 000 mg/L，抗蚜威對這2個(gè)地方的種群已基本失去防治效果。

2016年同樣地區(qū)桃蚜種群對抗蚜威抗性有不同程度的提升(表2)。其中，河北寬城種群抗性提升極其明顯，抗性倍數(shù)由0.80上升至67.51，遼寧大連、河北唐山、上海青浦、江蘇鹽城、江蘇宜興、江蘇大豐等種群抗性提升也非常明顯，抗性倍數(shù)均升高40以上，均處于高抗水平。2016年只有四川井研種群還處于敏感階段，LC50為153.15 mg/L，其他種群均已處于中、高水平抗性。同地區(qū)桃蚜種群對抗蚜威的抗性在2015年明顯高于2016年。

表2 2016年我國各地區(qū)桃蚜抗蚜威敏感度比較

2.2 抗蚜威對桃蚜敏感種群乙酰膽堿酯酶的抑制曲線

選用室內(nèi)反選育30代以上的敏感種群，采用酶標(biāo)儀動力學(xué)法測定抗蚜威對此敏感種群乙酰膽堿酯酶的抑制曲線(圖1)，計(jì)算抗蚜威抑制該敏感種群90%乙酰膽堿酯酶活性的濃度(IC90)。最終以抗蚜威濃度67.79 μmol/L(IC90)作為對其他供試種群乙酰膽堿酯酶的抑制濃度(診斷劑量)。

2.3 單頭桃蚜乙酰膽堿酯酶動力學(xué)測定

2.3.1 2016年桃蚜種群單頭桃蚜乙酰膽堿酯酶的動力學(xué)測定 為進(jìn)一步檢測桃蚜乙酰膽堿酯酶活性與抗藥性之間的關(guān)系，并根據(jù)乙酰膽堿酯酶活性頻率分布確定桃蚜的抗藥性水平，測定2015、2016年各地桃蚜種群單頭桃蚜的乙酰膽堿酯酶活性，單頭桃蚜乙酰膽堿酯酶頻率分布結(jié)果見圖2、圖3。

由圖2可知，2015年河北深澤種群乙酰膽堿酯酶動力學(xué)活性最高，為(55.91±8.57)×10-3ΔD405 nm/(min·頭)，江蘇高郵種群次之，為(49.81±9.7)×10-3ΔD405 nm/(min·頭)，江蘇鹽城、江蘇吳中種群活性相對較低，分別為(35.44±9.50)×10-3、(39.84±11.28)×10-3ΔD405 nm/(min·頭)，其他11個(gè)種群乙酰膽堿酯酶動力學(xué)活性分布于(40.41～49.53)×10-3ΔD405 nm/(min·頭)之間。但從圖2也可以看出，各種群間乙酰膽堿酯酶動力學(xué)活性差別不大。

由圖3可知，2016年桃蚜各地理種群乙酰膽堿酯酶動力學(xué)活性整體水平高于2015年，其中河北唐山種群最高，為(57.31±12.98)×10-3ΔD405 nm/(min·頭)，江蘇大豐最低，為(39.58±12.94)×10-3ΔD405 nm/(min·頭)，其他15個(gè)種群活性分布于(43.43～55.86)×10-3ΔD405 nm/(min·頭)之間，各地理種群乙酰膽堿酯酶動力學(xué)活性差異不明顯。

2.3.2 單頭桃蚜乙酰膽堿酯酶的抑制動力學(xué)測定 為檢測桃蚜乙酰膽堿酯酶活性與桃蚜對抗蚜威抗性的相關(guān)性，以明確我國桃蚜對抗蚜威產(chǎn)生高水平抗藥性的主要原因，以 67.79 μmol/L 抗蚜威為診斷劑量，在診斷劑量抑制下測定了2015、2016年各種群單頭桃蚜乙酰膽堿酯酶的殘存敏感度，又根據(jù)各種群乙酰膽堿酯酶活性(圖2、圖3)計(jì)算出乙酰膽堿酯酶活性殘留率，結(jié)果見圖4至圖7。

由圖4可知，2015年采集各地被測桃蚜種群中，河北深澤、河北寬城、上海青浦、遼寧大連種群乙酰膽堿酯酶對抗蚜威的敏感度明顯高于其他被測種群。由圖5可知，河北深澤、河北寬城、上海青浦、遼寧大連種群乙酰膽堿酯酶對抗蚜威(67.79 μmol/L)殘留率在20%左右，其他11個(gè)種群乙酰膽堿酯酶殘留率均為60%及以上。這一結(jié)果與2015年各地區(qū)桃蚜種群對抗蚜威抗性監(jiān)測的生物測定結(jié)果基本一致。

在2016年采集的種群中，河北廊坊、四川井研、四川資中種群乙酰膽堿酯酶對抗蚜威的敏感度明顯高于其他種群(圖6)。圖7為2016年采集各地桃蚜田間種群在抗蚜威診斷劑量(67.79 μmol/L)下乙酰膽堿酯酶殘留率。除河北廊坊、四川井研、四川資中種群乙酰膽堿酯酶對抗蚜威(67.79 μmol/L)殘留率低于20%，其他14個(gè)種群乙酰膽堿酯酶殘留率均為50%及以上，與2016年各地桃蚜種群對抗蚜威的抗性水平趨勢基本一致。

3 討論

2015年大部分地區(qū)種群(66%)對抗蚜威產(chǎn)生中高水平抗性。2016年同樣地區(qū)桃蚜種群對抗蚜威的抗性水平明顯高于2015年，表明我國桃蚜對抗蚜威抗性急劇升高。由抗性倍數(shù)也可以看出，2016年除四川井研、河北廊坊、四川資中種群處于低水平抗性外，其他14個(gè)種群均處于中、高水平抗性。

乙酰膽堿酯酶在昆蟲神經(jīng)傳導(dǎo)過程中水解神經(jīng)遞質(zhì)——乙酰膽堿，從而終止神經(jīng)沖動傳導(dǎo)。氨基甲酸酯類農(nóng)藥降低或阻止乙酰膽堿酯酶的正常水解作用，使神經(jīng)沖動傳導(dǎo)無法終止而致昆蟲死亡。乙酰膽堿酯酶對氨基甲酸酯類殺蟲劑不敏感，是桃蚜對抗蚜威產(chǎn)生抗性的重要原因[6-7，18]。在抗蚜威抑制濃度(診斷劑量)作用下，乙酰膽堿酯酶殘存活性越低，殘留率越低，則乙酰膽堿酯酶對抗蚜威的敏感度越高，桃蚜對抗蚜威越敏感；乙酰膽堿酯酶殘存活性越高，殘留率越高，則乙酰膽堿酯酶對抗蚜威的敏感度越低，桃蚜對抗蚜威的抗性越強(qiáng)。本研究對2015、2016年采自我國各地區(qū)桃蚜田間種群作單頭挑蚜乙酰膽堿酯酶動力學(xué)活性及殘存活性測定，其結(jié)果與室內(nèi)生物測定的結(jié)果基本一致，進(jìn)一步驗(yàn)證了不敏感乙酰膽堿酯酶是導(dǎo)致桃蚜對抗蚜威產(chǎn)生抗性的原因這一結(jié)論。基本可以確定，單頭桃蚜乙酰膽堿酯酶對抗蚜威的敏感度測定可以作為桃蚜抗蚜威抗性監(jiān)測的方法之一，同時(shí)對抗蚜威防治桃蚜的田間應(yīng)用具有一定的指導(dǎo)作用。