曹學(xué)彬， 王建波， 邢榮蓮， 姜愛莉

(1.山東東方海洋科技股份有限公司/國家海藻與海參工程技術(shù)研究中心，山東煙臺(tái) 264000； 2.煙臺(tái)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東煙臺(tái) 264005)

小分子量的多肽容易被人體吸收，具有對(duì)人體有益的各種生理功能[1-2]?？寡趸远嚯氖巧锘钚噪牡囊环N，通過減少氧自由基、羥自由基(·OH)從而達(dá)到抗衰老的功能[3-5]，使用安全性高。海參(Acaudinamolpadioidea)是典型的高蛋白、低脂肪、極低膽固醇、富含礦物質(zhì)和維生素的優(yōu)質(zhì)食品，體壁富含蛋白質(zhì)、皂苷、多糖等營養(yǎng)成分，具有多種保健功能及藥用價(jià)值，是制備生物活性多肽的理想原料[6-7]。

海參多肽具有良好的溶解性和穩(wěn)定性特點(diǎn)，易消化吸收，而且具有降血壓、預(yù)防心腦血管疾病、抗疲勞、提高免疫力、抗腫瘤、抗氧化、延緩衰老等生物活性[8-9]。來自海參的生物活性肽有兩大類，一類是存在于生物體中的天然多肽，如海參上皮組織中具有抗腫瘤和抗炎活性的五肽，由亮氨酸、脯氨酸、絲氨酸、精氨酸等氨基酸構(gòu)成，其中個(gè)別氨基酸為D-型[10]；另一類是海參生物蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)生的活性肽，如Zhao等連續(xù)酶解海參制備得到的ACE抑制多肽[11]。

不同種類的海參由于生活環(huán)境和攝食不同，其營養(yǎng)價(jià)值和生理功效也有所差異[12]。蘇永昌等研究了地瓜參多肽抗氧化活性[13]；趙芹等系統(tǒng)分析了不同分子量的刺參(Apostichopusjaponicus)、菲律賓刺參(Pearsonothuriagraeffei)、美國肉參(Isostichopusbadionotus)和冰島刺參(Cucumariafrondosa)等海參多肽抗氧化活性[14]；陳卉卉等對(duì)東海海參膠原多肽的制備及自由基清除功能進(jìn)行了研究[15]。

酶解水產(chǎn)品蛋白質(zhì)進(jìn)行深加工是經(jīng)常采用的一種加工方法，也是獲取抗氧化多肽的重要途徑[3-4]。曾慶祝等研究表明，枯草桿菌蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解扇貝邊所得酶解物具有較好的·OH清除效果，其清除率分別為84.37%、79.93%，這2種酶解物均可提高小鼠血液中谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)和超氧化物歧化酶(SOD)活性，并降低小鼠肝臟中丙二醛(MAD)含量[16]。

北極海參(Holothuriamexicana)產(chǎn)于北大西洋深海，無污染、純野生，營養(yǎng)豐富，蛋白質(zhì)占干物質(zhì)含量的60%以上。由于原產(chǎn)地居民不食用海參，北極海參價(jià)格顯著低于黃渤海刺參，目前對(duì)于北極海參的活性成分及活性研究報(bào)道較少，對(duì)其多肽的生理活性進(jìn)行深入研究，對(duì)該資源的開發(fā)利用具有較大的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

北極海參購自山東煙臺(tái)海參市場，常規(guī)方法水發(fā)，低溫保存?zhèn)溆谩Ｎ傅鞍酌?、胰蛋白酶購自北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司；中性蛋白酶、酸性蛋白酶、木瓜蛋白酶購自北京東華強(qiáng)盛生物技術(shù)有限公司；牛血清白蛋白標(biāo)品購自Sigma-Aldrich(上海)貿(mào)易有限公司。

1.2 方法

1.2.1 海參多肽的制備

1.2.1.1 海參體壁蛋白的提取 發(fā)制好的海參組織用搗碎機(jī)攪碎，加入10倍體積的0.1 mol/L NaOH溶液，40 ℃水浴攪拌12 h，離心收集上清，加入10%三氯醋酸(TCA)于4 ℃沉淀3 h，離心收集沉淀，丙酮反復(fù)洗滌至沉淀為白色，冷凍干燥得海參體壁蛋白。

1.2.1.2 酶解工藝流程 海參體壁蛋白溶解，分別加入5種蛋白酶溶液，酶的用量為2 500 U/g。分別在各種酶的最適條件下水解3 h，100 ℃加熱0.5 h滅酶，4 000 r/min離心，上清液中加入3倍體積無水乙醇，4 000 r/min離心10 min，收集上清液，即為海參多肽溶液。福林酚法檢測多肽含量。

1.2.2 體外抗氧化能力的測定

1.2.2.1 羥自由基(·OH)的體外清除作用 采用Fenton法[17-18]測定海參多肽對(duì)羥自由基(·OH)的體外清除作用，·OH采用EDTA Na2-Fe2+-H2O2體系產(chǎn)生。

清除率=(D樣品-D空白)/(D對(duì)照-D空白)×100%。

式中：D樣品、D空白、D對(duì)照分別為測試樣品、空白和對(duì)照的吸光度。

1.2.2.3 還原力的測定 參照Yen等的方法[20]。

1.2.3 海參多肽的分子量分布 采用安捷倫1 200高效液相色譜儀分析5種酶解多肽的分子量分布。色譜條件：TSK PW4000凝膠柱，柱溫25 ℃，自動(dòng)進(jìn)樣5 μL，流動(dòng)相為純凈水，流速1 mL/min，214 nm檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 海參多肽的制備

試驗(yàn)表明，酸性蛋白酶水解海參蛋白所得的酶解多肽(AP)得率最高，為89.7%；其次是胰蛋白酶酶解多肽(TP)，得率為88.6%，木瓜蛋白酶酶解多肽(PAP)得率為76.3%，中性蛋白酶酶解多肽(NP)得率為70.5%；胃蛋白酶水解蛋白所得的多肽(PP)得率最低，僅為70.5%。

2.2 5種酶解多肽對(duì)羥自由基的清除能力

由圖1可知，幾種酶解多肽對(duì)羥自由基的清除率均隨多肽濃度的增加而提高，當(dāng)TP、PAP、AP的濃度為1.6 mg/mL時(shí)，對(duì)羥自由基的清除率已經(jīng)達(dá)到100%。相同濃度下，木瓜蛋白酶酶解多肽PAP對(duì)羥自由基的清除能力最強(qiáng)，其半清除濃度IC50為0.277 mg/mL，中性蛋白酶酶解多肽NP的IC50為0.414 mg/mL，胰蛋白酶酶解多肽TP及酸性蛋白酶酶解多肽AP的IC50為0.342 mg/mL，胃蛋白酶酶解多肽對(duì)羥自由基的清除率最低。清除能力強(qiáng)弱順序?yàn)镻AP>TP≈AP>NP>PP。

2.3 5種酶解多肽對(duì)超氧陰離子的清除能力

由圖2可知，幾種酶解多肽對(duì)超氧陰離子的清除能力均隨多肽濃度的增加而提高，相同濃度下，胰蛋白酶酶解多肽TP對(duì)超氧陰離子的清除能力最強(qiáng)，IC50為 0.966 mg/mL，其次是酸性蛋白酶酶解多肽AP，IC50為 1.177 mg/mL，中性蛋白酶酶解多肽NP的IC50為 2.150 mg/mL，木瓜蛋白酶酶解肽PAP的IC50為 2.325 mg/mL，胃蛋白酶酶解多肽PP對(duì)超氧陰離子的清除率最低，尤其是在較高濃度下。清除能力強(qiáng)弱順序?yàn)門P>AP>NP>PAP>PP。

2.4 5種酶解多肽的還原能力

還原能力也是抗氧化能力的一個(gè)指標(biāo)，但是還原能力在抗氧化過程中所起作用大小目前還不清楚。從圖3可以看出，5種酶解多肽的還原能力均與濃度呈正相關(guān)，其中酸性蛋白酶酶解多肽AP的還原能力最強(qiáng)，其次是中性蛋白酶酶解多肽NP和胰蛋白酶酶解多肽TP，胃蛋白酶酶解肽PP和木瓜蛋白酶酶解肽PAP的還原能力相對(duì)較弱，遠(yuǎn)低于其他3種酶解多肽。

2.5 酶解海參多肽的高效液相分析

利用高效液相色譜分析5種海參酶解多肽的分子量分布，結(jié)果(圖4)顯示，胃蛋白酶酶解多肽PP的分子量分布范圍窄，肽段主要集中在8～20 ku，其中分子量為14 ku左右的占了大部分；中性蛋白酶酶解多肽NP的分子量分布范圍寬，低分子量肽段(小于7 ku)含量比較高；胰蛋白酶酶解多肽TP的分子量小于7 ku的占了大部分；酸性蛋白酶酶解多肽AP的分子量范圍分為兩部分，一部分在20～7 ku，另一部分在 7～3 ku；而木瓜蛋白酶酶解多肽PAP的大部分肽段分子量在20～14 ku，還有少量肽段分子量5～7 ku。

3 討論

對(duì)海洋生物的研究發(fā)現(xiàn)，多肽的生理作用與組成多肽的氨基酸序列有關(guān)[21-22]；一些生物活性肽的生理功能還與多肽的結(jié)構(gòu)、疏水性、所帶電荷等有關(guān)[23-24]。許多研究表明，海參多肽的抗氧化性與分子量密切相關(guān)，不同分子量范圍的海參多肽清除氧自由基的能力存在差異[25]，但抗氧化活性與分子量并不是呈正相關(guān)關(guān)系，多肽的抗氧化性還取決于組成多肽的氨基酸組成和序列[26]。由于短肽含有某些能與自由基反應(yīng)的特殊基團(tuán)即供氫基團(tuán)，只有當(dāng)這些短肽分子量適當(dāng)時(shí)，這些特殊的供氫基團(tuán)才能得到最大的暴露，進(jìn)而充分地與自由基作用，此時(shí)才具有較強(qiáng)的抗氧化性[26]。Qian等指出，含巰基的半胱氨酸能夠直接與自由基作用，對(duì)多肽的抗氧化性有重要貢獻(xiàn)[27]。Saiga等發(fā)現(xiàn)，含酸性氨基酸的短肽具有較好的抗氧化效果，原因是酸性氨基酸的側(cè)鏈羧基能鈍化金屬離子，終止自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)[28-30]。

本研究中所用的5種蛋白酶對(duì)于酶切位點(diǎn)的選擇性是有差異的。中性蛋白酶酶切位點(diǎn)多，對(duì)底物肽鍵的選擇性大，酶解得到的NP的分子量大部分集中在小分子量部分；酸性蛋白酶是將2個(gè)疏水氨基酸打斷，作為內(nèi)肽酶的同時(shí)還可以切開蛋白或多肽羧基或氨基末端肽鍵，游離出氨基酸，同時(shí)也可以水解蛋白多肽酯鍵，水解范圍相對(duì)較寬，但是對(duì)芳香族氨基酸沒有特異性；胃蛋白酶水解肽鍵兩端必須是疏水性氨基酸、芳香族氨基酸氨基與其他氨基酸形成的肽鍵，如果是脯氨酸則不水解，制備的多肽含有的芳香族氨基酸含量較少或者2個(gè)芳香族氨基酸在蛋白中的距離較遠(yuǎn)；胰蛋白酶酶切賴氨酸、精氨酸羧基與別的氨基酸形成的肽鍵，制備的蛋白內(nèi)含有賴氨酸及精氨酸的殘基相對(duì)要多；木瓜蛋白酶不但有蛋白酶、酯酶活性，還具有合成功能，可把蛋白水解物合成為類蛋白質(zhì)，可水解蛋白質(zhì)和多肽中賴氨酸和精氨酸的羧基端，并能優(yōu)先水解那些在肽鍵的N端具有2個(gè)羧基的氨基酸或芳香L-氨基酸的肽鍵，也可以通過切斷殼聚糖的β-1，4糖苷鍵降解植物細(xì)胞壁中殼聚糖。5種蛋白酶酶切位點(diǎn)的不同，酶解得到的多肽分子量及氨基酸殘基也有所不同，相應(yīng)地，表現(xiàn)出的體外抗氧化活性也就有較大的差異。

4 結(jié)論