王躍華， 陳 燕，2， 劉 曼， 劉媛媛， 羅晴方， 唐金容

(1.成都大學(xué)藥學(xué)與生物工程學(xué)院，四川成都 610106； 2.成都大學(xué)四川抗菌素工業(yè)研究所，四川成都 610052)

白芨[Bletillastriata(Thunb.) Reichb. f.]別稱冰球子、地螺絲、利知子、連及草等，為蘭科白芨屬多年生草本植物，具有收斂止血、消腫生肌的功效，主要用于咳血、吐血、外傷出血、瘡瘍腫痛、皮膚皸裂[1]?，F(xiàn)代研究表明，白芨具有愈合傷口、抗?jié)?、止血、?xì)胞毒性、抗微生物、抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗纖維化、抗衰老、抗過敏、抗瘙癢等藥理作用[2]。

隨著時(shí)代的發(fā)展，作為傳統(tǒng)中草藥、觀賞植物以及化妝品原料的白芨需求量劇增，加之野生白芨被過度濫采亂挖，白芨種子自然萌發(fā)率極低，繁殖困難，再加上傳統(tǒng)的人工栽培通常采用分株繁殖，繁殖效率低，周期長，因而白芨資源日益匱乏[3]。近年來，研究人員不僅對白芨資源的遺傳多樣性進(jìn)行研究，還進(jìn)行了離體快速繁殖研究，取得了一定的成果，且明確利用快速繁殖技術(shù)規(guī)模化生產(chǎn)白芨種苗是緩解白芨資源緊缺的有效方式之一[4-5]。而在白芨快速繁育技術(shù)研究中，種苗的健壯程度與根系的發(fā)達(dá)程度嚴(yán)重影響種苗移栽的成活率，是制約人工苗產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵。

本研究通過對白芨優(yōu)質(zhì)種苗增殖、生根壯苗、移栽煉苗3個(gè)生長階段的研究，獲得對實(shí)際生產(chǎn)具有指導(dǎo)意義的種苗培育方案，旨在優(yōu)化快速繁殖白芨種苗的培養(yǎng)條件，為白芨苗大規(guī)模人工培育提供技術(shù)支持，以緩解白芨藥材的緊缺及更有效地保護(hù)白芨資源。

1 材料與方法

1.1 供試材料與試驗(yàn)地點(diǎn)

試驗(yàn)材料來自成都大學(xué)生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室，選取繼代1次且株高為3～4 cm的單株優(yōu)質(zhì)白芨組培苗作為研究材料。試驗(yàn)于2016年10月至2017年3月在成都大學(xué)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 白芨苗的快速增殖生長研究 為探尋白芨苗快速增殖生長的最佳方案，本試驗(yàn)研究不同濃度的N-苯基-N′-1，2，3-噻二唑-5-脲(TDZ)、活性炭、馬鈴薯泥等對白芨苗增殖生長的影響，具體設(shè)計(jì)1/2 MS+(0.0、1.0、1.5、2.0 mg/L) TDZ+(0.0、3.0 g/L)活性炭+(30.0、50.0 g/L)馬鈴薯泥+30.0 g/L糖的A1、A2、A3、A4、A5、A6共6個(gè)不同培養(yǎng)基，培養(yǎng)60 d后統(tǒng)計(jì)白芨無根苗的增殖倍數(shù)。

1.2.2 白芨無根苗的生根培養(yǎng)研究 采用3因素4水平的試驗(yàn)，正交表選用L16(43)表頭設(shè)計(jì)。選取吲哚丁酸(IBA)、吲哚乙酸(IAA)、活性炭等3個(gè)因素，各水平見表1。研究白芨無根苗的生根情況，培養(yǎng)25 d后統(tǒng)計(jì)生根率。

表1 不定根誘導(dǎo)因子水平

1.2.3 白芨組培苗移栽 將生長健壯的組培苗取出，洗去基部的培養(yǎng)基，按表2中的4種不同方式處理后再移栽至疏松透氣富含腐殖質(zhì)的土壤。

表2 白芨組培苗移栽處理方法

1.2.4 試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 采用正交助手Ⅱ完成正交試驗(yàn)的設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析。各試驗(yàn)每組接種20瓶，每瓶5株，重復(fù)3次。增殖倍數(shù)=增殖后無根苗數(shù)/接種無根苗數(shù)；生根率=生根的幼苗數(shù)/接種的無根苗數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度激素和添加物對白芨無根苗增殖生長的影響

將健壯白芨幼苗接入不同培養(yǎng)基中培養(yǎng)60 d，無根苗增殖結(jié)果見表3。從表3可以看出，TDZ、活性炭和馬鈴薯泥組合會更有利于白芨幼苗的增殖和生長。在沒有添加TDZ的A1培養(yǎng)基中，培養(yǎng)60 d后，白芨組培苗的增殖倍數(shù)僅為1.1倍，為6種配方中最低；在添加相同種類、濃度的激素與馬鈴薯泥的條件下，添加了活性炭比未添加活性炭組的增殖倍數(shù)明顯增加；改變馬鈴薯泥的含量對白芨苗的平均增殖倍數(shù)也有一定的影響。TDZ濃度在0.0～1.5 mg/L時(shí)，白芨苗增殖倍數(shù)隨其濃度增大而提高，當(dāng)TDZ濃度為1.5 mg/L時(shí)，增殖倍數(shù)最大，高達(dá)10.0倍。通過A3與A6比較可以看出，當(dāng)TDZ濃度升高到2.0 mg/L時(shí)，增殖倍數(shù)有所下降。活性炭的添加對白芨苗增殖有一定影響，添加了活性炭的A3組增殖倍數(shù)明顯高于未添加活性炭的A5組，且活性炭除了對白芨苗增殖倍數(shù)有影響，還對白芨苗的生長有明顯影響，通過觀察發(fā)現(xiàn)，A3與A5比較，葉片顏色更綠、莖更加粗壯。馬鈴薯泥的添加對白芨苗的增殖倍數(shù)也有一定的影響，添加 50.0 g/L 馬鈴薯泥的A4增殖倍數(shù)高于添加30.0 g/L馬鈴薯泥的A3，馬鈴薯泥與活性炭相似，除了對增殖倍數(shù)有影響外，不同的馬鈴薯泥含量對白芨苗的生長狀況也有較為明顯的影響。通過觀察發(fā)現(xiàn)，A4與A3相比，A4的白芨苗葉片更大，莖更加粗壯，原球莖直徑也更大，因此添加50.0 g/L馬鈴薯泥更有利于白芨苗的增殖和生長。因此，設(shè)計(jì)的6個(gè)方案中，A4組為白芨無根苗增殖最佳方案，即白芨無根苗最佳增殖培養(yǎng)基為1/2 MS+1.5 mg/L TDZ+3.0 g/L活性炭+50.0 g/L馬鈴薯泥+30.0 g/L糖。

表3 不同濃度激素和添加物對白芨幼苗增殖生長的影響

2.2 白芨無根苗的生根誘導(dǎo)研究

植物激素的種類、濃度以及活性炭對于白芨生根起著十分重要的作用。為了探究激素和活性炭對白芨生根的影響，本試驗(yàn)以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別添加不同濃度和配比的IBA、IAA、活性炭等3種物質(zhì)，組合成16種不同的培養(yǎng)基，培養(yǎng)25 d后統(tǒng)計(jì)結(jié)果。從表4可以看出，白芨無根苗在16種不同培養(yǎng)基中均可誘導(dǎo)生根，但其生根率差異明顯。在9號培養(yǎng)基中，白芨無根苗誘導(dǎo)生根率最高，達(dá)100.00%，而1號培養(yǎng)基的白芨無根苗生根誘導(dǎo)率最低，僅為24.69%。R代表各因素每個(gè)水平的平均值，R值越大，代表該因素此水平越好。從各水平的平均值可以看出，白芨生根的最佳培養(yǎng)基為A3B2C2。經(jīng)驗(yàn)證得出，最佳培養(yǎng)方案條件下培養(yǎng)25 d后白芨無根苗的生根率達(dá)100.00%，與同等條件下9號培養(yǎng)方案培養(yǎng)的白芨苗相比，新生根的條數(shù)更多、長度相當(dāng)，且更有粗壯，更有利于后期移栽，因而最終確定白芨無根苗生根的最佳培養(yǎng)基為MS+0.5 mg/L IBA+0.1 mg/L IAA+2.0 g/L 活性炭。極差值R越大表明此因素越重要，通過極差分析可知，3種因素對白芨無根苗生根誘導(dǎo)率的影響表現(xiàn)為A>C>B，即IBA濃度>活性炭用量>IAA濃度。說明培養(yǎng)基中IBA濃度對無根苗誘導(dǎo)生根的影響最大，其次是活性炭用量，影響最小的是IAA濃度。

表4 不定根誘導(dǎo)試驗(yàn)結(jié)果

2.3 方差分析

為了進(jìn)一步比較各因素對生根誘導(dǎo)的影響和探究3個(gè)因素之間的聯(lián)系，在極差分析的基礎(chǔ)上進(jìn)行了方差分析。從表5的方差分析結(jié)果可知，本研究3個(gè)因素中只有因素A對試驗(yàn)結(jié)果有顯著影響。其中因素A檢驗(yàn)值F=3.51，F(xiàn)0.05(3，3)=3.49，F(xiàn)0.01(3，3)=5.95，F(xiàn)0.05

表5 不定根誘導(dǎo)結(jié)果方差分析

注：“*”表示該因素的顯著性為顯著(0.01

2.4 煉苗和移栽

選取生長健壯的組培苗，洗去基部的培養(yǎng)基，按不同處理方式處理后移栽至土壤中，觀察新根的生長情況，并在培養(yǎng) 30 d 后統(tǒng)計(jì)側(cè)芽萌發(fā)率。從表6可以看出，將白芨組培苗浸泡在30%的生根劑中處理15 min后移栽最快長出新根，說明生根劑對白芨生根有正向的影響。且B2組移栽 30 d 后，側(cè)芽萌發(fā)率最高，達(dá)86.12%，明顯高于其他處理方式。桂炳中指出甲基硫菌磷內(nèi)吸性較強(qiáng)，會隨液流向植株頂部進(jìn)行傳導(dǎo)，影響細(xì)胞分裂[6]。本試驗(yàn)B4組使用甲基硫菌磷的側(cè)芽萌發(fā)率最低可與其相佐證。綜合白芨組培苗移栽后的生根與側(cè)芽萌發(fā)情況，B2是白芨組培苗移栽的最佳處理方案，即將組培苗根浸泡在30%的生根劑中15 min后移栽至土壤中。

表6 不同處理方式對白芨幼苗生長的影響

3 討論與結(jié)論

3.1 白芨幼苗的增殖

TDZ為人工合成的苯基脲衍生物，如今被廣泛應(yīng)用于植物組織培養(yǎng)中，是一種高效生物調(diào)節(jié)劑，它具有生長素和細(xì)胞分裂素的雙重作用，且活性比一般細(xì)胞分裂素類高幾十至幾百倍。目前在白芨組培中對TDZ運(yùn)用較少，多數(shù)白芨幼苗的研究使用的是一般常見植物激素，如石云平等認(rèn)為6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)是白芨苗增殖的良好激素[7-8]。而余朝秀等的研究表明，激動(dòng)素(KT)更有利于白芨苗的增殖，在MS+4.0 mg/L KT+0.2 mg/L萘乙酸(NAA)培養(yǎng)基中培養(yǎng)40 d后，增殖率可達(dá)450%[9]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，TDZ有利于白芨不定芽的分化，以1.5 mg/L TDZ效果最好，增殖倍數(shù)最高達(dá)10.0倍，與楊海蕓在研究蝴蝶蘭的離體培養(yǎng)中得到的結(jié)果[10]一致。

活性炭作為吸附能力極強(qiáng)的一種無機(jī)吸附劑，在植物離體培養(yǎng)中，能吸附培養(yǎng)基中自身含有或植物生長過程中釋放的有害物質(zhì)。王紅梅指出，適量的添加活性炭可以抑制白芨組培苗褐化，這是因?yàn)榛钚蕴课搅瞬糠址宇?、醌類等有害物質(zhì)，使多酚氧化酶與過氧化物酶失活，從而有效地防止組培苗褐變，并且活性炭還能吸附瓊脂中所含的雜質(zhì)以及蔗糖在高壓下消毒產(chǎn)生的5-羥甲基糠醛[11]。本研究低濃度的活性炭與TDZ聯(lián)合使用達(dá)到了很好的增殖效果，究其原因，一方面活性炭吸附了培養(yǎng)基中的有害物質(zhì)與部分TDZ，從而優(yōu)化了白芨苗的生存環(huán)境，另一方面活性炭不斷吸附植物生長過程中產(chǎn)生的生長抑制物質(zhì)。因此活性炭有利于白芨苗的增殖和生長，且與TDZ聯(lián)合使用更加有利于白芨苗的增殖和生長。

3.2 白芨生根與移栽煉苗

白芨苗生根情況的好壞直接影響著后期移栽的成活率，在整個(gè)快速繁育體系中占據(jù)至關(guān)重要的地位。林伊利等都是以NAA作為誘導(dǎo)激素且誘導(dǎo)效果較好[12-13]。本研究通過正交試驗(yàn)表明IBA對白芨苗生根誘導(dǎo)的影響較大，且是影響白芨苗生根的顯著性因素。后期在探究白芨苗的不定根誘導(dǎo)時(shí)可以著重比較一下IBA、NAA以及兩者組合使用的誘導(dǎo)效果。

白芨組培苗煉苗的土質(zhì)是一個(gè)重要因素，已有眾多學(xué)者探討了土質(zhì)對白芨組培苗的影響，如鄒娜等研究發(fā)現(xiàn)，蛭石作為試管苗的移栽基質(zhì)效果最好，幼苗生長能力強(qiáng)，且存活率高達(dá)95%以上[14]。本研究表明移栽時(shí)對白芨苗的處理也是一個(gè)重要因素，試驗(yàn)中將白芨組培苗根浸泡在30%生根劑中 15 min 后移栽，有利于新根的生長和側(cè)芽的萌發(fā)。而經(jīng)過甲基托布津處理后，新根生長與側(cè)芽萌發(fā)均不理想，說明在移栽白芨組培苗時(shí)生根劑類物質(zhì)會使白芨組培苗更快生根且更易存活下來，而甲基托布津類物質(zhì)會抑制白芨組培苗的生長。