劉 麗，姜 華，潘東升，張 琳，張 頔，謝 寅，齊衛(wèi)紅，張 翊，邵 彥，王麗穎，于永利，李 波

（1.中國食品藥品檢定研究院國家藥物安全評價(jià)監(jiān)測中心，藥物非臨床安全評價(jià)研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100176；2.云南沃森生物技術(shù)有限公司，云南昆明 650106；3.長春華普生物技術(shù)有限公司，吉林長春 130012；4.吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，吉林長春 130021）

乙型病毒性肝炎是嚴(yán)重危害人類健康的傳染性疾病，由乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染所致。據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前全球有約20億人感染HBV，我國HBV感染者近1億人，其中慢性乙肝患者約2000萬例，每年有2%～10%發(fā)展為肝硬化，部分可發(fā)展為肝癌，預(yù)后較差［1-2］。接種乙肝疫苗是預(yù)防乙肝的主要方法。傳統(tǒng)的乙肝疫苗使用鋁佐劑，以HBV表面抗原（HBV surface antigen，HBsAg）為免疫原。免疫功能正常人群中有5%～10%接種該疫苗后不能產(chǎn)生持久的血清保護(hù)性抗體［3］。另外，鋁佐劑經(jīng)常會引起注射部位的不良反應(yīng)，并且通常誘導(dǎo)偏向于輔助性T細(xì)胞2（T helper cells 2，Th2）型的免疫應(yīng)答，易引起過敏反應(yīng)［4-5］。因此，需要對疫苗的佐劑系統(tǒng)進(jìn)行改進(jìn)，以誘導(dǎo)產(chǎn)生更持久、更高水平的免疫反應(yīng)，并提高疫苗安全性，滿足臨床需求。

應(yīng)用新型佐劑的疫苗研究成為熱點(diǎn)，能誘導(dǎo)平衡的Th1/Th2型免疫應(yīng)答的疫苗被認(rèn)為具有更好的免疫原性和安全性［6-8］。含CpG基序的寡聚脫氧核苷酸（oligodeoxynucleotides containing CpG motifs，CpG ODN）具有較強(qiáng)的免疫刺激作用，可促進(jìn)Th1型免疫反應(yīng)，近年來被作為新型佐劑用于多種不同類型的疫苗中［9-12］。CpG 684是我國自行設(shè)計(jì)合成的一種B型CpG ODN，CpG 684-乙肝疫苗是我國制藥企業(yè)以CpG 684聯(lián)合鋁佐劑乙肝疫苗制備的一種新型疫苗。為考察CpG 684-乙肝疫苗的非臨床安全性，本研究對食蟹猴重復(fù)im給予該疫苗，觀察其產(chǎn)生的不良反應(yīng)及其嚴(yán)重程度、主要毒性靶器官及損害的可逆程度，為臨床設(shè)計(jì)人用劑量、臨床不良反應(yīng)的監(jiān)測提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 受試物和對照品

CpG 684-乙肝疫苗，批號20080702，為淡乳白色混懸液，裝在預(yù)填充注射器內(nèi)，每支0.5 mL。由重組（漢遜酵母）乙肝疫苗〔含AL（OH）3佐劑〕加CpG 684制備而成。由長春華普生物技術(shù)有限公司研發(fā)，特定序列為5′-TCGACGTTCGTCGTTCGTC?GTTC-3′，專利號為03140821.4，其凍干粉批號：080701，內(nèi)毒素含量＜100 EU·g-1（云南沃森生物技術(shù)有限公司），50 μg CpG 684-乙肝疫苗組（CpG 50 μg 組）：每 0.5 mL 含 50 μg CpG 684+10 μg HBsAg，500 μg CpG 684-乙肝疫苗組（CpG 500 μg組）：每0.5 mL 含500 μg CpG 684+10 μg HBsAg。2種濃度疫苗（0.5 mL）中均含0.25 mg AL（OH）3。本研究所用疫苗與臨床擬用制劑制備方法和所含成分完全相同，CpG 500 μg組與臨床規(guī)格完全一致，CpG 50 μg組僅CpG 684的添加量低于臨床擬用制劑。穩(wěn)定性試驗(yàn)表明，本研究所用受試物2～8℃條件下可存放2年。所用CpG 684溶媒對照品為0.9%氯化鈉注射液。受試物和溶媒對照品均由云南沃森生物技術(shù)有限公司提供，2～8℃條件下避光保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物和飼養(yǎng)條件

食蟹猴30只，購入時(shí)2～3歲，雌雄各半，繁育單位為海南金港實(shí)驗(yàn)動物科技有限公司，許可證號：SCXK（瓊）2004-0001。免疫開始時(shí)體質(zhì)量范圍：雌性，1.95～2.65 kg；雄性：2.10～3.30 kg。不銹鋼籠具飼養(yǎng)，每籠1只。飼養(yǎng)室溫度16～26℃，日溫差≤3℃，相對濕度40%～70%，換氣次數(shù)為每小時(shí)8～10次，照明每天12 h。定量給予膨化猴料和水果（比例為1∶1，北京科澳協(xié)力飼料有限責(zé)任公司），每日總給料量約300 g，由飲水瓶自由飲用自來水。食蟹猴購入后檢疫，適應(yīng)環(huán)境4周后用于試驗(yàn)。本研究在開始前已通過本單位動物福利倫理委員會的倫理審批。

1.3 試劑和儀器

血液學(xué)測定試劑（北京佳康瑞得醫(yī)用電子儀器有限公司）；血清生化測定試劑（北京周天華楓醫(yī)療儀器有限公司）；乙肝抗體檢測用辣根過氧化物酶（horse radish peroxidase，HRP）標(biāo)記兔抗猴IgG抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；包被用HBsAg（云南沃森生物技術(shù)有限公司）；抗核抗體ELISA檢測試劑盒（歐蒙醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)診斷有限公司）；檢測白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）流式細(xì)胞微珠法（cyto?metricbeadarray，CBA）（美國BDPharmingen公司）。

ADVIA 120血液分析儀和Rapidchem 744電解質(zhì)分析儀（德國拜耳公司）；CA-1500血凝分析儀（日本Sysmex公司）；HITACHI 7060型全自動生化分析儀（日本日立公司）；顯微鏡（日本Olympus公司）；Tissue-Tek TEC包埋機(jī)、Tissue-Tek VIP6-E2脫水機(jī)、Tissue-Tek DRS染色機(jī)和Tissue-Tek Glas封片機(jī)（日本SAKURA公司）；MICROX SPINNER血細(xì)胞離心涂片機(jī)（日本OMRON公司）；Shandon Cytospin4骨髓細(xì)胞離心涂片機(jī)（美國Thermo公司）。

1.4 分組設(shè)計(jì)和免疫次數(shù)

30只食蟹猴隨機(jī)分為3組：溶媒對照組、CpG 50 μg疫苗組和CpG 500 μg疫苗組。每組10只，雌雄各半。在第0，2，4和6周im免疫各1次，共4次，每次0.5 mL。設(shè)計(jì)依據(jù)：CpG 684-乙肝疫苗臨床擬用于≥18歲人群乙肝補(bǔ)充免疫，采用0，1和6個(gè)月3針免疫。臨床擬用疫苗中每針含500 μg CpG 684和10 μg HBsAg抗原（按成人體質(zhì)量60 kg計(jì)，分別為8.3 μg·kg-1和0.17 μg·kg-1）。在食蟹猴重復(fù)給藥毒性研究中設(shè)定2個(gè)劑量組，分別為每針50 μg CpG 684+10 μg HBsAg和500 μg CpG 684+10 μg HBsAg。按本試驗(yàn)食蟹猴平均體質(zhì)量2.5 kg計(jì)，經(jīng)體質(zhì)量折算，2組CpG 684的劑量分別為20和200 μg·kg-1，分別為成人擬用劑量的 2.4 倍和24倍。臨床試驗(yàn)中擬固定乙肝疫苗HBsAg的劑量，因此，食蟹猴毒性試驗(yàn)中亦固定乙肝疫苗HBsAg的劑量不變，均為每針10 μg，即4 μg·kg-1，為成人擬用劑量的24倍，免疫次數(shù)比臨床擬定免疫次數(shù)多1次。

1.5 癥狀觀察和體質(zhì)量等指標(biāo)的測定

試驗(yàn)期間每天觀察食蟹猴的癥狀和下肢股四頭肌注射部位刺激性，每周1次測定體質(zhì)量，每天測定攝食量，首次免疫后1 d、末次免疫后1 d和4周測定體溫和心電圖。

1.6 血液學(xué)和血清生化指標(biāo)的測定

檢疫期第15天和第24天、首次免疫后3 d、末次免疫后1 d和4周分別進(jìn)行血液學(xué)和血清生化測定。文中僅顯示部分測定結(jié)果。

1.7 食蟹猴血清HBsAb測定

免疫前，首次免疫后2，4，6，8和10周采血，分離血清，將血清置-80℃冰箱內(nèi)保存，試驗(yàn)結(jié)束后ELISA法統(tǒng)一進(jìn)行HBsAb測定。用HBsAg 10mg·L-1包被96孔板，每孔100 μL，4°C包被15 h。洗滌后每孔加300 μL 1%BSA封閉液，37°C孵育2 h，之后每孔加100 μL 25倍稀釋的血清樣品，37°C孵育1 h。洗滌后每孔加100 μL HRP標(biāo)記兔抗猴IgG抗體（1000倍稀釋），37℃孵育1 h。洗滌后加鄰苯二胺底物液，37℃避光顯色15 min后終止顯色。用酶標(biāo)儀讀取492 nm波長下的吸光度值（A492nm）。各實(shí)驗(yàn)組血清樣本A492nm值大于溶媒對照組A492nm值2.1倍，判定為陽性。

1.8 ELISA法檢測血清細(xì)胞因子和抗核抗體水平

檢疫期、首次免疫后1周、第3次免疫后1周和末次免疫后4周，CBA法測定血清中IL-6和TNF-α水平；第3次免疫后1 d、末次免疫后1 d和4周ELISA試劑盒測定抗核抗體水平。

1.9 病理學(xué)檢查

末次免疫后3 d和4周分別對部分食蟹猴麻醉后進(jìn)行解剖和大體病理學(xué)檢查（末次免疫后3 d解剖動物數(shù)為每組雌雄各3只，末次免疫后4周解剖動物數(shù)為每組雌雄各2只），對主要組織器官和病變部位進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。固定后的組織經(jīng)修塊取材，逐級乙醇脫水，石蠟包埋，滑動切片機(jī)切片（厚約3 μm），經(jīng)蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，光鏡下檢查。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)均采用x±s表示，使用的統(tǒng)計(jì)軟件是TOXSTAT2006。①首先用Bartlett檢驗(yàn)方法進(jìn)行數(shù)據(jù)均一性檢驗(yàn)。如數(shù)據(jù)均一，則進(jìn)行方差分析檢驗(yàn)（F檢驗(yàn)）；如Bartlett檢驗(yàn)的結(jié)果顯著（P＜0.05），則進(jìn)行Kruskal-Wallis檢驗(yàn)。②如方差分析檢驗(yàn)結(jié)果顯著（P＜0.05），則進(jìn)一步用Dunett參數(shù)檢驗(yàn)法進(jìn)行多重比較檢驗(yàn)；如方差分析結(jié)果不顯著，則統(tǒng)計(jì)結(jié)束。③如Kruskal-Wallis檢驗(yàn)結(jié)果顯著（P＜0.05），則進(jìn)一步用Dunett非參數(shù)檢驗(yàn)法進(jìn)行多重比較檢驗(yàn)；如Kruskal-Wallis檢驗(yàn)結(jié)果不顯著，則統(tǒng)計(jì)結(jié)束。應(yīng)用Fisher精確檢驗(yàn)（Fisher′s exact test）進(jìn)行病理學(xué)檢查計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)組間統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果

2.1 CpG 684-乙肝疫苗對食蟹猴體質(zhì)量等指標(biāo)的影響

試驗(yàn)期間，給予CpG 684-乙肝疫苗的食蟹猴均未見異常癥狀，疫苗未引起過敏反應(yīng)，注射部位肉眼觀察均未見異常。與溶媒對照組相比，各實(shí)驗(yàn)組體質(zhì)量變化、攝食量、體溫和心電圖指標(biāo)變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（數(shù)據(jù)略）。

2.2 CpG 684-乙肝疫苗對食蟹猴血液學(xué)和血清生化指標(biāo)的影響

血液學(xué)檢測結(jié)果（表1）顯示，首次免疫后3 d，與溶媒對照組相比，CpG 500 μg組雌性食蟹猴單核細(xì)胞百分比顯著增加，為溶媒對照組的2倍（P＜0.01）；免疫結(jié)束時(shí)，CpG 500 μg 組雌性食蟹猴單核細(xì)胞百分比仍高于溶媒對照組（P＜0.05）；末次免疫后4周2組無明顯差異。以上結(jié)果說明，CpG 500 μg組CpG 684-乙肝疫苗引起雌性食蟹猴外周血單核細(xì)胞增加。血清生化檢查結(jié)果（表2）顯示，第1次免疫后3 d，雌性CpG 50 μg組甘油三酯水平顯著低于溶媒對照組（P＜0.05）。

Tab.1 White blood cell differential count data of cynomolgus macaques immunized with CpG 684-HBV vaccine

Tab.2 Serum chemistry data of cynomolgus macaques immunized with CpG 684-HBV vaccine

2.3 CpG 684-乙肝疫苗的食蟹猴免疫效果

HBsAb檢測結(jié)果顯示（圖1），免疫前各組食蟹猴血清中的HBsAb為陰性，免疫后2周，疫苗免疫組只有1只食蟹猴血清HBsAb呈陰性，其它血清HBsAb均呈陽性。免疫后4周起，疫苗免疫組所有食蟹猴血清HBsAb呈陽性。雌雄食蟹猴HBsAb水平無明顯差異。隨免疫時(shí)間延長，HBsAb水平出現(xiàn)上升趨勢，在首次免疫后6～8周達(dá)到高峰，到10周時(shí)抗體水平有所下降。CpG 500 μg組雄性猴血清中的HBsAb水平在第6，8和10周時(shí)均高于CpG 50 μg組（P＜0.05），CpG 50 μg組雌性猴HBsAb水平在免疫后第6周高于CpG 500 μg組（P＜0.05）。

Fig.1 Serum HBsAb levels in male（A）and female（B）cynomolgus macaques immunized with CpG 684-HBV vaccine.See Tab.1 for the treatment.，n=5.＊P＜0.05，compared with CpG 50 μg vaccine group.

2.4 CpG 684-乙肝疫苗免疫后血清IL-6、TNF- α和抗核抗體水平的變化

細(xì)胞因子檢測結(jié)果（表3）顯示，在首次免疫后1周，雄性CpG 500 μg組IL-6水平高于溶媒對照組（P＜0.05），雌性CpG 50和500 μg組TNF-α水平低于溶媒對照組（P＜0.05）；第3次免疫后1周，雄性CpG 500 μg組TNF-α水平低于溶媒對照組（P＜0.05），但變化的幅度均很小，說明在所測時(shí)間點(diǎn)，給予CpG 684-乙肝疫苗對食蟹猴血清中IL-6和TNF-α水平無顯著影響。

抗核抗體測定結(jié)果顯示，第3次免疫后1 d、末次免疫后1 d和4周各組食蟹猴血清抗核抗體均為陰性（數(shù)據(jù)略）。

2.5 CpG 684-乙肝疫苗免疫后食蟹猴組織病理變化

食蟹猴大體病理學(xué)檢查未見與疫苗相關(guān)的異常變化。CpG 50和500 μg組僅各有1只食蟹猴可見注射部位肌肉輕度肌纖維變性，其余食蟹猴均未見肌纖維變性、壞死，表明im給予CpG 50和500 μg疫苗對肌纖維無明顯刺激性作用。CpG 50和500 μg疫苗均可誘導(dǎo)注射部位肌束間輕至中度炎癥細(xì)胞浸潤，對照組只有1只食蟹猴有肌束間輕度炎癥細(xì)胞浸潤灶，恢復(fù)期結(jié)束時(shí)疫苗組局部炎癥反應(yīng)無明顯消退。免疫結(jié)束及恢復(fù)期結(jié)束，除CpG 50 μg組1只食蟹猴可見肌束間中度纖維組織增生外，其他各組均未見肌束間明顯纖維組織增生，受試物致纖維化作用較輕。免疫結(jié)束后4周，其局部炎癥反應(yīng)有恢復(fù)，但未能完全消退。CpG 684-乙肝疫苗對注射局部淋巴結(jié)、胸腺及脾未引起顯著應(yīng)激性病理反應(yīng)。其余鏡檢器官或組織未見特異性組織病理學(xué)改變（數(shù)據(jù)略）。

Tab.3 Serum IL-6 and TNF- α level of cynomolgus macaques immunized with CpG 684-HBV vaccine

3 討論

CpG ODN的免疫調(diào)節(jié)作用被認(rèn)為是通過直接或間接激活表達(dá)Toll樣受體9（Toll-like receptor-9，TLR9）的細(xì)胞來實(shí)現(xiàn)的，這些細(xì)胞包括漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞（plasmacytoid dendritic cells，PDC）、巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞和單核細(xì)胞等［13-14］。TLR9激活后的B細(xì)胞和PDC表達(dá)協(xié)同刺激分子CD86，CD80和CD40增加，促進(jìn)Th1型免疫反應(yīng)的趨化因子和細(xì)胞因子的分泌增加，可誘導(dǎo)機(jī)體固有免疫和獲得性免疫反應(yīng)偏向于Th1型的細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)［15］，機(jī)體的Th1樣免疫環(huán)境對于細(xì)胞內(nèi)病毒感染的預(yù)防和治療非常重要［16］。由于CpG ODN的強(qiáng)免疫刺激作用，對其安全性也存在著一些擔(dān)憂。有相關(guān)研究報(bào)道，CpG ODN可引起一些副作用，如合成的CpG ODN可誘導(dǎo)小鼠胃炎的發(fā)生［17］；對HLA-B＊57：01轉(zhuǎn)基因小鼠同時(shí)給予CpG ODN和阿巴卡韋（一種人免疫缺陷病毒逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑），可引起谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性升高和肝損傷病變［18］。有研究顯示，對小鼠和大鼠皮下或腹腔內(nèi)注射給予一定劑量的CpG ODN會引起發(fā)育毒性［19-20］。因此，對以CpG ODN為佐劑的疫苗進(jìn)行系統(tǒng)的安全性評價(jià)非常重要。

不同的動物種屬表達(dá)TLR9的細(xì)胞種類有所區(qū)別，TLR9在嚙齒類動物免疫細(xì)胞的表達(dá)要比哺乳類的廣泛［21］。因此，使用非人靈長類動物進(jìn)行非臨床安全性評價(jià)比使用嚙齒類動物對臨床的預(yù)測價(jià)值更大。CpG 684是我國自行設(shè)計(jì)合成的一種全硫代修飾B型CpG ODN。前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本疫苗中的佐劑CpG 684可使食蟹猴外周血單個(gè)核細(xì)胞表達(dá)協(xié)同刺激分子CD86和CD80明顯增加。食蟹猴是CpG 684的敏感動物，而恒河猴的敏感性則相對較低。因此，選擇食蟹猴作為實(shí)驗(yàn)動物進(jìn)行CpG 684-乙肝疫苗安全性評價(jià)更有意義。

疫苗對實(shí)驗(yàn)動物有免疫原性是進(jìn)行安全性評價(jià)的前提。HBsAb檢測顯示，CpG 50和500 μg組CpG 684-乙肝疫苗在食蟹猴均誘導(dǎo)了較好的免疫應(yīng)答，抗體水平呈一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系。多數(shù)食蟹猴在首次免疫后2周即產(chǎn)生了一定水平的抗體，抗體產(chǎn)生較早。其他疫苗研究中也發(fā)現(xiàn)，CpG 684可促進(jìn)產(chǎn)生更早和更高水平的抗體［22］，這與CpG ODN增強(qiáng)細(xì)胞免疫的作用有關(guān)，是其作為疫苗佐劑應(yīng)用的重要優(yōu)勢。本研究中，各劑量疫苗在首次免疫和末次免疫后引起雌性食蟹猴外周血單核細(xì)胞數(shù)量增加，為可逆性改變。在大鼠肌注CpG 684共28 d毒性研究和小鼠重復(fù)肌注CpG 684-狂犬疫苗毒性研究中，也發(fā)現(xiàn)免疫組單核細(xì)胞數(shù)量增加［23-24］，與本研究結(jié)果一致。單核細(xì)胞有趨化作用和吞噬作用，可識別并加工處理抗原，并把抗原呈遞給淋巴細(xì)胞，引起免疫反應(yīng)。單核細(xì)胞表達(dá)TLR-9，CpG 684可促進(jìn)單核細(xì)胞活化和增殖［23］。因此，本研究中單核細(xì)胞數(shù)量增加與反復(fù)注射含CpG 684的乙肝疫苗引起免疫反應(yīng)增強(qiáng)有關(guān)，是疫苗藥理效應(yīng)的體現(xiàn)，也非毒性作用，符合研究預(yù)期。第1次免疫后3 d，雌性CpG 50 μg組甘油三酯水平雖然顯著低于溶媒對照組（P＜0.05），但與自身檢疫期甘油三酯測定結(jié)果相比無明顯變化，因此該差異為動物間的個(gè)體差異，與給予疫苗無關(guān)。

首次免疫后1周、第3次免疫后1周、末次免疫后4周分別檢測猴血清中細(xì)胞因子IL-6和TNF-α水平，未見與給予疫苗相關(guān)的變化。本研究是應(yīng)用CBA法直接測定食蟹猴血清中的細(xì)胞因子，猴血清中細(xì)胞因子的基礎(chǔ)水平較低。此外，細(xì)胞因子在體液或組織中的變化可能是短暫的過程，受食蟹猴實(shí)驗(yàn)采血頻率和采血量的限制，其出現(xiàn)顯著變化的時(shí)間點(diǎn)較難捕捉，這也可能是疫苗免疫后未能檢測到前述Th1型細(xì)胞因子升高的原因之一。從疫苗安全性方面考慮，說明在檢測的幾個(gè)重要時(shí)間點(diǎn)，細(xì)胞因子未明顯升高，也未引起過度炎癥反應(yīng)。血清抗核抗體陰性結(jié)果提示，疫苗未引起自身免疫反應(yīng)。

本研究發(fā)現(xiàn)，CpG 684-乙肝疫苗對食蟹猴多次肌注，僅誘導(dǎo)了輕至中度的肌束間炎癥反應(yīng)，炎癥細(xì)胞浸潤病變程度與疫苗劑量無明顯關(guān)系，表明疫苗肌注后沿局部肌束間浸漬，誘導(dǎo)局部肌束間炎癥細(xì)胞浸潤。疫苗未引起明顯纖維組織增生，也未引起注射部位肌肉的嚴(yán)重變性和壞死等不良反應(yīng)，肉眼觀察注射部位未見明顯異常。這說明局部刺激性較小，是應(yīng)用ODN作為疫苗佐劑的優(yōu)勢之一，符合研究預(yù)期。此外，本疫苗在誘導(dǎo)較好免疫反應(yīng)的同時(shí)，未引起過敏反應(yīng)和其他明顯的毒性作用，具有較好的開發(fā)前景。本研究主要是在食蟹猴進(jìn)行CpG 684-乙肝疫苗的安全性評價(jià)，伴隨開展的免疫原性研究中未進(jìn)行進(jìn)一步抗體滴度檢測，可在今后的研究中補(bǔ)充。另外，只在免疫后3個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行了猴血清中2種細(xì)胞因子的檢測，在今后的研究中可增加檢測時(shí)間點(diǎn)，并對更多種細(xì)胞因子進(jìn)行檢測，以更全面地評價(jià)疫苗對細(xì)胞免疫的影響。

綜上所述，在本研究條件和應(yīng)用劑量下，CpG 684-乙肝疫苗除引起食蟹猴外周血單核細(xì)胞數(shù)量增加、注射部位肌肉輕度炎癥反應(yīng)外，未引起其他明顯的毒性作用，本疫苗對食蟹猴具有較好的免疫原性和安全性。本研究為評價(jià)新型CpG 684-乙肝疫苗的非臨床安全性提供了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，為臨床設(shè)計(jì)人用劑量和臨床不良反應(yīng)的監(jiān)測提供了參考依據(jù)。