樊勝南，喻國輝，陳燕紅，黎永堅，陳川雁

（珠海市現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展中心，廣東 珠海 519075）

香蕉枯萎病是由尖孢鐮刀菌古巴專化型（Fusarium oxysporum f.sp.cubense）引起的毀滅性病害，是一種典型的土傳病害，病菌蔓延快，防治難度大。生產(chǎn)上常見的措施包括抗病品種選育、化學防治、生物防治和輪作等，生物防治具有環(huán)境污染小、安全程度相對較高并具有綜合調(diào)控等優(yōu)勢，越來越受到青睞［1］，可用于香蕉枯萎病防治的生防菌包括木霉（Trichoderma spp.）、假單胞菌（Pseudomonas spp.）、芽胞桿菌（Bacillus spp.）和放線菌（Actinomycetes）等［2］。近年來的研究顯示香蕉根際微生物群落與枯萎病的發(fā)生關系密切。土壤病原菌濃度越高香蕉越容易發(fā)生枯萎?。?］，發(fā)病級別越重的土壤病原菌數(shù)量也越高［4］。病原菌的存在還能夠顯著提高真菌數(shù)量及其比例，顯著降低放線菌及其比例［5］，發(fā)病嚴重的植株根際細菌和放線菌數(shù)量顯著減少，真菌數(shù)量顯著增加［6］。利用芽胞桿菌制備的有機肥能夠防治粉蕉的病害［7］，防治效果與土壤微生物群落發(fā)生改變有關，其中功能細菌在防治效果中具有重要作用［8］。枯草芽胞桿菌R31施用后能夠增加中粉1號粉蕉根際細菌的總量，減少根際真菌、放線菌和鐮刀菌的總量［9］。

枯草芽胞桿菌TR21是一株分離自石斛蘭葉片的植物內(nèi)生細菌［10］，對多種植物病原真菌和細菌具有廣譜拮抗活性，能夠在香蕉體內(nèi)定殖［11］并引起香蕉抗病酶［12］和相關基因［13］表達的升高，在大田試驗中對香蕉枯萎病表現(xiàn)出一定的防效［14-16］。為了了解田間施用TR21對香蕉根際土壤微生物的影響，我們采集了施用TR21可濕性粉劑灌根處理前后不同時期的香蕉根際土壤，采用DGGE方法對根際土壤微生物多樣性進行分析，以期為揭示該菌的防效機制和指導田間應用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 土壤樣品 試驗共采集10個土壤樣品。土壤樣品于2015年采集自珠海市現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展中心試驗田，每個標樣按照常規(guī)5點取樣后混合作為1個標樣。將土壤裝入無菌塑料袋內(nèi)封口，帶回實驗室4℃下保存?zhèn)溆?。土樣樣品信息如下：土?1：對照區(qū)香蕉種植前土壤；土樣52：生防菌處理區(qū)香蕉種植前土壤；土樣71：對照區(qū)香蕉生長初期土壤；土樣72：生防菌處理區(qū)香蕉生長初期土壤；土樣101：對照區(qū)香蕉生長中期土壤；土樣102：生防菌處理區(qū)香蕉生長中期土壤；土樣b20：生防菌處理區(qū)發(fā)病植株根際土壤；土樣b24：對照區(qū)發(fā)病植株根際土壤；土樣j20：生防菌處理區(qū)健康植株根際土壤；土樣j24：對照區(qū)健康植株根際土壤。

1.1.2 供試菌株 大腸桿菌（Escherichia coli DH5α）和枯草芽孢桿菌TR21可濕性粉劑由本實驗室提供。

1.1.3 酶及主要試劑 過硫酸銨、EDTA、去離子甲酰胺、瓊脂糖M、甲叉雙丙烯酰胺、Tris、丙烯酰胺等試劑購自上海生工生物公司；DNA純化試劑盒Wizard DNA Clean-up System購自Promega公司；土壤細菌DNA提取試劑盒Soil DNA Kit（50）、瓊脂糖凝膠回收試劑盒E.Z.N.A Gel Extraction Kit和質(zhì)粒抽提試劑盒Plasmid Mini Kit I（50）購自Omega Bio-Tek公司；pMD19-T載體、DNA分子量標準、Premix Ex Taq Version 2.0等購自TAKARA公司；硝酸銀、氯仿等購自廣州化學試劑廠。引物合成與測序由Invitrogen公司完成。土壤抽提緩沖液含100 mmol/L Tris-HCl、100 mmol/L EDTA-Na2、1.5 mol/L NaCl、1%CTAB、100 mmol/L Na3PO4，pH 8.0。

1.2 試驗方法

1.2.1 土壤總DNA提取 稱取0.5 g土樣到滅菌50 mL離心管中，加入13.5 mL土壤抽提緩沖液和10 μL蛋白酶K，37℃、225 r/min搖床30 min。加入1.5 mL 20% SDS，65℃水浴2 h（每隔15～20 min搖勻1次），6 000 r/min離心10 min，上清轉(zhuǎn)入另一個50 mL滅菌離心管中，原離心管中再加入4.5 mL土壤抽提緩沖液和0.5 mL 20%SDS。用玻璃棒攪勻，漩渦混勻器混勻10 s，65℃水浴10 min，6000×g離心10 min，合并上清。加等體積的酚-氯仿-異戊醇（25∶24∶1）抽提1次，6000×g離心5 min，取上清于另一滅菌離心管中。再加入等體積的氯仿-異戊醇（24∶1）抽提1次，6 000 r/min離心5 min后取上清于另一滅菌離心管中。在上清中加入0.1倍體積的3 mol/L NaAc（pH 5.2）混勻，加入0.6倍體積異丙醇室溫沉淀DNA 1 h。室溫16 000 r/min離心20 min，棄上清。DNA沉淀用70%乙醇洗滌1次，自然風干后將DNA沉淀溶于600 μL滅菌的TE緩沖液中，-20℃保存。

1.2.2 巢式PCR 參照歐陽嫻等［17］的方法，第1次PCR：所用引物為細菌通用引物F27（5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3’）和 V3 高變區(qū) R518（5’ATTACCGCGGCTGCTGG 3’）。第2次PCR：以第1次PCR產(chǎn)物為模板，引 物 為 F338GC（5’-CGCCC GCCGC GCGCG GCGGG CGGGG CGGGG GCACG GGGGG ACTCC TACGG GAGGC AGCAG-3’）和 R518。

1.2.3 變性梯度凝膠電泳（DGGE） 采用濃度為8%聚丙烯酰胺凝膠，變性梯度46%～54%，PCR純化產(chǎn)物上樣量400 ng，凝膠于60℃，80 V電泳12 h，銀染，拍照。

1.2.4 DGGE電泳圖譜分析 參照歐陽嫻等［17］的方法，使用Quantity one V4.6軟件對DGGE電泳圖譜進行分析，再用Sorenson配對比較相似性系數(shù)Cs比較相似性。

1.2.5 DGGE主條帶回收與基因克隆測序 將清晰可見的條帶切下，用滅菌的去離子水清洗后，加入30 μL滅菌去離子水并將膠帶搗碎，60℃溫浴1 h，4℃靜置16 h，3 000 r/min離心收集上清液。取1 μL上清液，用F338和R518引物進行PCR擴增，擴增程序同第2次PCR。PCR產(chǎn)物一部分用于再次DGGE電泳，驗證條帶是否是原來的條帶，另一部分用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠條帶用E.Z.N.A Gel Extraction Kit回收。然后取4.5 μL回收產(chǎn)物連接至p MD19-T載體，轉(zhuǎn)入100 μL大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞，然后加入800 μL LB液體培養(yǎng)基37℃復蘇培養(yǎng)1 h，5 000 r/min離心1 min后，去掉800 μL上清液，加入20 μg/mL的X-gal 40 μL和200 μg/mL的IPTG 7 μL混勻，然后均勻涂布于含50 μg/mL氨芐青霉素的LB平板上，37℃倒置培養(yǎng)過夜。用滅菌的牙簽隨機挑選陽性克隆子于5 mL含50 μg/mL氨芐青霉素的LB液體中，37℃、180 r/min振動培養(yǎng)過夜（14～16 h），12 000 r/min離心1 min收集菌體，用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒。質(zhì)粒用HindII和EcoRI進行雙酶切鑒定無誤后，送往Invitrogen公司（上海）測序，測序結果通過NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫比對。

2 結果與分析

2.1 土壤樣品的變性梯度凝膠電泳（DGGE）分析

對10個土壤樣品的擴增產(chǎn)物進行DGGE分析，結果見圖1。從圖1可以看出，10個土壤樣品都分離到若干條帶，且?guī)陀兴煌Ｔ谙憬斗N植晚期的發(fā)病植株根際樣品中，對照區(qū)（b24）條帶比處理區(qū)（b20）少、且明亮條帶多，與處理區(qū)健康植株根際樣本j24相比，部分條帶變?nèi)趸蛳?，顯示發(fā)病后有部分條帶消失。j20樣品經(jīng)芽胞桿菌TR21處理，其土壤微生物的多樣性比j24有非常明顯的提高，說明用芽胞桿菌TR21可濕性粉劑灌根可以提高土壤的微生物多樣性。

圖1 10個土壤樣品16S rDNA V3 片段DGGE分析結果

2.2 DGGE圖譜的物種豐度和微生物多樣性指數(shù)分析

利用Quantity one軟件對DGGE圖譜進行識別條帶的分析，得到圖譜的物種豐度S值和生物多樣性指數(shù)H值，如圖2所示。圖2顯示，運用芽胞桿菌TR21處理可以提高土壤的生物多樣性，隨著時間的推移，處理區(qū)和對照區(qū)香蕉根際微生物的豐富度均逐漸升高，而多樣性則逐漸減小。種植前，對照區(qū)的土樣（51）生物多樣性和豐富度高于處理區(qū)（52）。使用枯草芽胞桿菌TR21處理后，無論是在香蕉生長初期（71和72）還是中期（101和102），處理區(qū)（72和102）的生物多樣性和物種豐富度均高于對照（71和101）。但在香蕉種植后期，施用過生防菌的發(fā)病植株根際土壤樣品（b20），檢測出來物種豐度（S）比對照（b24）高，但生物多樣性（H）比對照低，健康植株根際土樣（b20與b24）的物質(zhì)豐富度和生物多樣性與發(fā)病植株的特征一致?？梢姡谰幚砗笠鹞锓N豐富度增加，但生物多樣性降低。

圖2 10個土壤樣品物種豐度和微生物多樣性分析

利用Quantity one軟件對DGGE圖譜進行識別條帶的分析得到DGGE的UPGMA聚類分析結果見圖3。微生物種群多樣性聚類分析顯示j24和j20兩個土樣的微生物相似最高，達到68%，即香蕉種植后期用TR21處理過的健康植株根際土壤微生物與未使用TR21處理的健康植株根際土壤微生物相似性較高。此外，生防菌處理的發(fā)病土壤b20的微生物多樣性接近未發(fā)病的健康土壤j24，相似性達到60%，而對照區(qū)的發(fā)病土壤樣品b24與健康組土壤的相似度只有52%，說明枯草芽胞桿菌TR21處理對香蕉根際土壤的微生物生態(tài)改變較大，可以提高生物多樣性，具有穩(wěn)定土壤生物多樣性的能力。

圖3 10個土壤樣品的16SrDNA V3片段DGGE條帶的微生物種群多樣性的聚類分析

2.3 發(fā)病土壤DGGE圖譜主條帶回收及序列比對

對DGGE圖譜上的差異條帶進行回收和測序，測序結果經(jīng)NCBI Blast比對分析，結果見圖4和表2。從表2可以看出，有9個條帶與GenBank數(shù)據(jù)庫中的非培養(yǎng)細菌克隆子相似，目前尚無菌屬信息。其中條帶9為生防菌處理區(qū)特有的條帶，測序結果顯示其為芽胞桿菌。

圖4 回收條帶示意圖

3 結論與討論

本研究利用PCR-DGGE法對香蕉種植不同時期TR21灌根處理與對照的香蕉植株根際土壤進行微生物多樣性分析，發(fā)現(xiàn)隨著種植時間的推移，處理和對照的根際土壤微生物豐度S值都逐漸升高，多樣性指數(shù)H值卻逐漸降低，說明隨著香蕉種植時間的延長，根際微生物中少數(shù)物種的數(shù)量越來越突出，這與鄧建波等的研究一致，這些微生物的變化這可能與香蕉根系分泌物對根際微生物產(chǎn)生的選擇性有關［18］。發(fā)病香蕉根際土壤的物種豐富度S值小于健康香蕉根際土壤的S值，這與鄧曉等［4，18］的研究結果一致；然而，用TR21處理過的根際土壤的物種豐度S值一直都大于對照，而生物多樣性指數(shù)H值卻比對照小，且經(jīng)TR21處理的根際土壤芽孢桿菌增多，說明TR21的施用對土壤微生物群落產(chǎn)生了影響，在增加物種豐富度的同時，選擇性增加了某些類群的數(shù)量，降低了群落的均勻度，從而導致S值增大、H值減小。

表2 DGGE圖譜差異條帶的核苷酸序列的比對結果

枯草芽胞桿菌TR21施用對香蕉枯萎病產(chǎn)生的防效可能與其對香蕉根際芽胞桿菌種群產(chǎn)生的影響有關。芽胞桿菌是香蕉根區(qū)土壤細菌的第一優(yōu)勢種群［19］，數(shù)量和比重的變化與香蕉枯萎病的發(fā)生關系密切。相關研究顯示，芽胞桿菌產(chǎn)生的脂肽Surfactin可以作為信號分子影響自身或其他芽胞桿菌的生物被膜形成［20］，而生物被膜形成過程中產(chǎn)生的同類相殘機制也會進一步影響到芽胞桿菌的種群分化和生物被膜形成［21］，這兩種影響生物被膜形成的方式是根際芽胞桿菌種間互作［22］和親緣辨識的基礎［23］，也是解釋芽胞桿菌施用能夠調(diào)控和影響土壤芽胞桿菌的理論基礎。例如，與TR21一同分離自石斛蘭葉片的枯草芽胞桿菌R31，在田間也能夠防治香蕉枯萎?。?4-15］，對香蕉根際可培養(yǎng)微生物計數(shù)發(fā)現(xiàn)，R31灌根能夠顯著增加根際芽胞桿菌含量［9］，健康植株根際分離的優(yōu)勢種芽胞桿菌可以與R31相互識別并影響群游和生物被膜的形成［24］。本研究則通過PCRDGGE的方式進一步證實這種調(diào)控和影響的確存在，這將為進一步利用芽胞桿菌作為生防因子控制香蕉枯萎病提供了理論和實踐依據(jù)。