梁曉靜 ，梁海英 ，梁文匯 ，李開祥

（1.廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學研究院 a.八角肉桂工程中心；b.廣西特色經濟林培育與利用重點實驗室；c.廣西木本香料工程技術研究中心，廣西 南寧 530002；2.克萊姆森大學，南卡羅來納州 克萊姆森 29634）

肉桂C.cassia在我國已有2 000多年的栽培歷史，主要分布在北回歸線附近地區(qū)[1]，廣西和廣東是肉桂的主產區(qū)，其中廣西的分布面積最廣，約占全國的50%以上。此外，福建、海南、云南和四川等省區(qū)也有少量栽培[2]。國內種植的當家品種為中國肉桂，經過長期的人工栽培和自然選擇，已經形成了不同品種和品系，在廣西，肉桂按產地分為“東興桂”和“西江桂”[3]。西江桂主要分布在藤縣、平南、桂平、岑溪、容縣、蒼梧、梧州等地，而東興桂主要分布在防城、上思、大新和龍州等地[4]。

清化肉桂C.cassiavar.macrophyll產自越南清化省，亦稱西貢桂，清化肉桂桂皮品質好，在國際市場上享有較高榮譽，Dao在過去20多年里研究越南樟屬植物，認為所謂的清化桂其實與中國肉桂是同一個種，但是由于收獲和加工工藝的不同，越南清化桂和中國肉桂的產品在外表上有著很大的差別[5]。邢繼真對清化肉桂和中國肉桂桂皮的顯微結構進行了對比分析，結果表明，兩者的顯微結構部基本一致，但清化肉桂的石細胞和木纖維較少，細胞內含紅棕色物質多[6]。傅火帶研究比較了清化肉桂和中國肉桂揮發(fā)油的差異，認為清化肉桂辣味小，葉油的折光率、含醛量高，成分有所不同，認為是兩個不同的種[7]。

植物的葉片是進行光合作用和蒸騰作用的主要器官[8]，其形態(tài)結構在一定程度上說明其對環(huán)境的適應性和進化機制，以及種源地環(huán)境對植物形態(tài)結構的影響程度[9]。不少學者應用葉片的解剖特征作為分析親緣關系的佐證，邱芬等研究了不同倍性滇楊葉解剖結構特征，結果表明，對滇楊進行加倍處理之后，其葉片解剖結構與二倍體對照相比較發(fā)生了顯著變化[10]。招禮軍等對5個種源鵝掌楸葉解剖性狀進行分析，發(fā)現(xiàn)其解剖性狀在種間和種內存在著豐富的變異[11]。

目前對于不同品種肉桂的研究主要包括：揮發(fā)油成分[12]、葉形態(tài)多樣性[13]、遺傳物質多樣性[14]、木材結構特性[15]等方面，而葉片解剖結構比較尚未見報道。本研究通過對不同品種肉桂葉片結構的顯微觀察，探索相同生態(tài)和栽培條件下，不同肉桂品種葉片解剖結構的差異，旨在為品種分類和肉桂資源的研究利用提供相關依據。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

位于廣西南寧市北郊，108°21′E，22°56′N，海拔95 m，屬亞熱帶季風氣候區(qū)，光照充足，年均日照時數為1 600 h～1 800 h；雨量豐沛，年降水量1 347.2 mm；空氣濕潤，年平均相對濕度為80%；氣候溫和，年均氣溫在21.6 ℃左右，≥10 ℃年有效積溫在7 200 ℃，極端最低溫-1.5 ℃，極端最高溫度39.4 ℃，一般年份有2～4 d輕微霜凍；土壤是由沙頁巖發(fā)育而成的赤紅壤，pH值為4.5～6.0之間。

1.2 試驗材料

供試的肉桂品種為越南清化肉桂和中國西江肉桂的優(yōu)良單株家系，為V-1，V-2，C-1、2、3、4、5、6、7、8、11號等11個家系，2006年，分別于越南清化省和廣西平南縣篩選的優(yōu)良單株并采集成熟種子，進行實生苗培育，2007年春季，將一年生不同優(yōu)良單株家系苗木定植于廣西林科院肉桂資源圃，株行距為2 m×2 m，定植后按常規(guī)方法管理。

1.3 測定方法

每個樣本選擇3株，選取生長一致，健康無病蟲害的、向陽的葉片，連中脈一起剪成1.0 cm×0.5 cm的小塊，立即放入FAA固定液中，固定24 h以上，再用不同梯度的酒精脫水，二甲苯透明，石蠟滲透包埋，用石蠟切片機切成4～10 μm厚的切片，脫水，番紅-固綠染色，中性樹膠封片，用Olympus光學顯微鏡觀察。

1.4 數據分析

每個葉片選取3個橫切面，每個切面選取3個視野，每個視野測量一組數據，觀測指標包括葉片厚度、上表皮厚度、下表皮厚度、柵欄組織厚度、海綿組織厚度、柵海比、木質部厚度、韌皮部厚度、中脈厚度、中脈突起度。按照以下公式計算柵海比和葉片突起度。柵海比=柵欄組織厚度/海綿組織厚度，葉脈突起度(MPD) = 中脈橫切面厚度/葉片橫切面厚度。所有數據均用SPSS 13.0進行多重比較、主成分分析以及聚類分析。

2 結果與分析

2.1 葉片橫切面解剖結構比較

如圖1所示，中國肉桂和越南肉桂的橫切結構均為典型的異面葉，由表皮、葉肉和葉脈三部分組成，上表皮細胞近方形，排列緊密，一層，厚度13.56～17.37 μm，下表皮為一層近圓形細胞，排列不規(guī)則，體積較上表皮細胞大，厚度為15.49～19.12 μm。肉桂葉肉細胞分化為柵欄組織和海綿組織，柵欄組織由1～2層柱狀細胞組成，排列較為疏松，厚度為52.06～56.62 μm，海綿組織細胞分布十分疏松，厚度為122.4～174.95 μm，柵海比為0.30～0.43 μm。葉脈為離基三出脈，中脈較粗，厚度為820.15～1 110.74 μm，其上表皮細胞與維管束之間有3～5層厚角組織，下表皮內有6～8層排列疏松、體積較大的薄壁細胞，維管束為外韌維管束，橫切面呈扇形，維管束近軸面為發(fā)達的木質部，木質部厚度為136.05～238.36 μm，由多列徑向排列的導管和木射線，遠軸面為韌皮部，韌皮部厚度為64.47～88.17 μm。韌皮部外為多層薄壁細胞組成的維管束鞘。

圖1 不同品種肉桂葉片解剖結構Fig.1 Leaf anatomical structure of different varieties of C.cassia

由表1不同品種肉桂葉橫切面解剖特征多重比較可知，清化肉桂2個家系和中國肉桂9個家系的葉片厚度、上表皮厚度、海綿組織厚度、柵海比、木質部厚度、中脈厚度之間存在顯著性差異，而下表皮厚度、柵欄組織厚度及中脈突起度之間差異不顯著。清化肉桂的葉片厚度、海綿組織厚度、木質部厚度及中脈厚度的平均值分別為251.69、170.09、234.49、1 077.29 μm 顯著大于中國肉桂家系，中國肉桂家系葉片厚度、海綿組織厚度、木質部厚度及中脈厚度的平均值分別為219.35、132.46、164.92、868.59 μm。清化肉桂的柵/海為0.31，中國肉桂柵/海為0.41，顯著小于中國肉桂。

2.2 肉桂品種各表型性狀的相關性分析

肉桂葉解剖結構10個指標的相關性如表2所示，兩兩指標之間相關性最高的是葉片厚度和海綿組織厚度，相關系數達0.976，其次是海綿組織厚度與中脈厚度，相關系數達0.969，葉片厚度與木質部厚度、中脈厚度之間也呈極顯著正相關（均為r=0.947），木質部厚度與海綿組織厚度、中脈厚度之間呈極顯著相關性，相關系數分別為0.942和0.930。負相關系數最大的海綿組織與柵/海之間，相關系數為-0.949，其次是中脈厚度與柵/海之間，相關系數為-0.904。

表1 不同品種肉桂葉橫切面解剖特征多重比較Table 1 Multiple comparison of anatomical features of transverse section of different varieties of C.cassia

表2 肉桂葉片解剖結構指標的相關性分析Table 2 Correlation analysis of anatomical structure index of leaves

2.3 不同品種肉桂葉片解剖結構特征的主成分分析

肉桂葉解剖結構的主成分分析如表3所示，前2個主成分的貢獻率分別為63.290%、17.378%，累積貢獻率達80.668%，說明這兩個主成分概括了10個解剖結構指標的主要信息。在第一主成分中，葉片厚度、柵欄組織厚度、海綿組織厚度、木質部厚度、中脈厚度以及中脈突起度等指標的特征向量均為正值，其中木質部厚度的載荷量最大，為0.982，其次是葉片厚度、中脈厚度以及海綿組織厚度，載荷量分別為0.979、0.973和0.963。第二主成分中，信息載荷量最大的是下表皮厚度，為0.819，其次是韌皮部厚度，載荷量為0.727，其他指標的信息載荷量均低于0.700。

表3 肉桂葉片解剖結構特征的主成分分析Table 3 Principal component analysis of anatomical features of C.cassia leaves

10個變量集中于兩個個主成分中，以第一主成分特征向量為橫坐標，第二主成分特征向量為縱坐標，兩個個主成分相互垂直，構成一個平面，葉片解剖結構指標形成2個分布群，第一個分布群由木質部厚度、葉片厚度、中脈厚度、海綿組織厚度、中脈突起度等5個指標組成，第二個分布區(qū)群由柵欄組織厚度、韌皮部厚度、上表皮厚度、下表皮厚度和柵欄/海綿組織厚度等5個指標組成（圖2所示）。

圖2 旋轉因子載荷分布圖像Fig.2 Load distribution diagram of rotation factor

2.4 基于葉片橫切面解剖特征的不同品種肉桂聚類分析

根據葉片解剖結構10個指標對肉桂的11個家系進行聚類分析，結果見圖3，當截取值約為4時，11個家系分成兩組，V-1和V-2聚為一類，而中國肉桂9個家系聚為一大類，其中第二大類又分為兩個亞類，第一亞類為C-1和C-5，第二亞類為 C-2、C-3、C-4、C-6、C-7、C-8、C-11， 越 南清化肉桂2個家系與中國肉桂9個家系的遺傳距離最大，而中國肉桂的各個家系之間的截取值較小，這說明，越南清化桂與中國肉桂葉片解剖結構之間存在明顯的差異。

圖3 基于葉片橫切面解剖特征的不同品種肉桂聚類圖Fig.3 Cluster maps based on the anatomical characteristics of the transverse section

3 結論與討論

越南清化肉桂的桂皮又稱南玉桂，品質優(yōu)于中國肉桂，國際市場上，清化肉桂桂皮價格遠遠高于中國肉桂[4]，享有較高聲譽。有些學者認為清化桂是中國肉桂的大葉變種，也有研究認為清化桂和中國肉桂是同一個種，產品和外表上的差別是收獲方式和加工工藝不同所造成[5]。

為了探討中國肉桂和越南清化肉桂的親緣關系，運用數量分析法對不同品種肉桂家系間葉的解剖結構特征量進行分析，從而將不同種分開。有不少學者運用數量分析法對群體間特定解剖結構特征量進行分析，以將不同的種或品種分開，例如張永福等基于葉片解剖特征分析了3種無患子科果樹的親緣關系，得到三月紅是荔枝的一個變種，龍荔是由龍眼進化到荔枝一個中間過渡物種的結論[16]。鄭瑞等對61個油茶品種的葉片及中脈橫切面解剖特征進行了觀察，并對品種間的親緣關系進行了初步研究并編制了分類檢索表，研究結果說明：葉片橫切面解剖特征可作為區(qū)分油茶品種的依據之一[17]。

植物葉片內部結構相對穩(wěn)定，各組織厚度及比值等結構特征是植物遺傳性的反映，可作為植物分類的依據[18]。葉解剖結構的差異是遺傳因子和環(huán)境因子共同作用的結果[11]，供試的2個肉桂品種11個家系來自同一時期，同一區(qū)域，出現(xiàn)的差異是植物葉片內部的遺傳物質作用下形成的不同形態(tài)結構。中國肉桂和越南清化肉桂在葉的主要特征上表現(xiàn)出較高的一致性比如葉的輪廓，脈序，柵欄組織層和海綿組織層的分化程度，中脈結構的排列等方面。而在葉片厚度、海綿組織厚度、柵海比、木質部厚度、中脈厚度等方面存在顯著的差異。

主成分分析中，前兩個主成分累積貢獻率達到80.668%，說明這兩個主成分概括了10個性狀指標的主要信息，可以反映不同品種肉桂在葉解剖結構上的差異[19]。第一主成分貢獻率為63.290%，木質部厚度的載荷量最大，其次是葉片厚度，中脈厚度，海綿組織厚度，這四個指標信息載荷量最大，都達到0.900以上，是區(qū)分肉桂不同品種最主要的解剖結構。聚類分析中，越南清化肉桂2個家系與中國肉桂9個家系各聚為一類，且遺傳距離最大，進一步說明清化桂和中國肉桂葉解剖結構之間存在明顯的差異，是遺傳距離較遠的種，這與之前肉桂葉表型性狀的研究結果一致[14]，認為中國肉桂與越南清化肉桂是兩種不同的肉桂品種。

前人對植物親緣關系的鑒別經歷了形態(tài)學、孢粉學、同工酶等研究方法，但這些研究方法受主觀影響較大[20,21]。除了闡明不同親緣物種共存的形態(tài)學和表型性狀外，從植物生理生化、分子、蛋白質組和代謝組學水平上解析植物親緣識別的機制將是下一階段研究的重點[22]。肉桂品種分類仍然是按照形態(tài)指標為主，存在主觀因素的影響，分類結果仍有爭議，今后肉桂種質資源親緣關系的研究將以分子標記以及基因組測序技術、指紋圖譜構建、目標基因定位及其連鎖圖譜繪制等方面為主。為合理利用肉桂資源提供指導。