胡霞，陳方方，孔陳蘇

(1.四川省八一康復(fù)中心、四川省康復(fù)醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，四川 成都 611135；2.新疆維吾爾自治區(qū)鄯善縣人民醫(yī)院醫(yī)務(wù)部，新疆 鄯善 838200)

帕金森病(PD)是老年人常見(jiàn)的運(yùn)動(dòng)障礙。其主要病理特征是紋狀體中多巴胺能神經(jīng)元的退化和壞死。臨床表現(xiàn)為肌僵直、靜止性震顫等。目前國(guó)內(nèi)外帕金森病的發(fā)病機(jī)制一直處于探討中，而在臨床治療上也缺乏有效的抗氧化應(yīng)激以及神經(jīng)保護(hù)治療措施[1-4]。PD形成的重要原因與α-突觸核蛋白的異常聚集相關(guān)，這更容易在氧化應(yīng)激環(huán)境中聚集和促進(jìn)多巴胺能神經(jīng)元的進(jìn)行性退化和壞死[5]。DJ-1蛋白參與基因轉(zhuǎn)錄、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、維持mRNA的穩(wěn)定性以及參與抗氧化應(yīng)激等過(guò)程。在對(duì)抗氧化應(yīng)激治療中，氧化應(yīng)激的敏感性的增加是由于DJ-1基因的缺陷引起的[6-7]。此外，DJ-1基因可保護(hù)細(xì)胞免受大鼠多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞系和原代多巴胺細(xì)胞過(guò)氧化氫(H2O2)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[9-10]。本研究自2016年1月至2017年7月建立了用H2O2處理的PC12多巴胺能神經(jīng)元的體外氧化應(yīng)激模型，探討 DJ-1對(duì)多巴胺能神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用與機(jī)制，為PD的發(fā)病機(jī)制和治療方法提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1主要儀器和試劑冷凍高速離心機(jī)，購(gòu)買于Thermo Fisher公司；酶標(biāo)儀，購(gòu)買于Bio-rad公司；熒光顯微鏡，購(gòu)買于Olympus公司；熒光定量PCR儀，購(gòu)買于Bio-rad公司；蛋白電泳儀，購(gòu)買于Bio-rad公司。

大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞系(PC12細(xì)胞)及胎牛血清(Gibco)購(gòu)買于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞研究所；H2O2購(gòu)買于上海遠(yuǎn)大公司；DHE超氧陰離子熒光探針購(gòu)買于碧云天公司； DJ-1抗體、TH蛋白抗體和β-actin抗體購(gòu)買于Abcom公司；CCK-8試劑盒購(gòu)買于BBI life sciences公司；RNA提取試劑盒購(gòu)買于上海杰瑞生物技術(shù)有限公司；逆轉(zhuǎn)錄和定量PCR試劑盒均購(gòu)買于TAKARA。

1.2PC12細(xì)胞培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化將 PC12細(xì)胞系置于 RPMI1640培養(yǎng)基中(含有10只滅活的小牛血清，青霉素100 U·mL-1，鏈霉素100 U·mL-1， L-谷氨酰胺0.12 g·L-1， NaHCO33 g·L-1)，37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將100 μg·L-1神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)加入PC12細(xì)胞培養(yǎng)基中進(jìn)行分化。隔天更換培養(yǎng)液，培養(yǎng)液中事先加入 NGF，誘導(dǎo)分化進(jìn)行8 d。形態(tài)學(xué)鑒定后，將已經(jīng)分化成多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞的PC12細(xì)胞系進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷模型在96孔板中接種 PC12細(xì)胞，處理組分別加入50、100、150 μmol·L-1的H2O2，空白對(duì)照組不加H2O2，在1.5 h和3 h后分別采用 CCK-8法檢測(cè) PC12細(xì)胞活性。

1.4DJ-1過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建DJ-1基因序列由Bioengineering Biotechnology(Shanghai)Co.，Ltd。合成和限制性內(nèi)切核酸酶KpnI和XbaI設(shè)計(jì)在序列的兩端。隨后將片段連接到pCDH1-cmv載體上。采用氨芐青霉素用于篩選陽(yáng)性克隆抽提質(zhì)粒，進(jìn)行DNA序列測(cè)定，驗(yàn)證基因序列和表達(dá)框是否正確。

1.5細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)水平檢測(cè)處理3 h后，加入用50、100、150 μmol·L-1H2O2處理的PC12細(xì)胞培養(yǎng)基，并用PBS洗滌2次。隨后用5 μmol·L-1的DHE染色30 min，DAPI染核。在熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.6PI/Hoechst染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡在96孔板中接種 PC12細(xì)胞，處理組分別加入50、100、150 μmol·L-1的H2O2，空白對(duì)照組不加H2O2，反應(yīng)24 h。PI / Hoechst染色顯微鏡下觀察PC12細(xì)胞凋亡，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.7蛋白質(zhì)免疫印跡法(WesternBlot)檢測(cè)使用RIPA裂解物裂解細(xì)胞，裂解上清液并使用BCA試劑盒測(cè)量蛋白質(zhì)濃度。通過(guò)半干電泳將SDS-PAGE凝膠電泳應(yīng)用于PVDF膜，并將第一抗體在4 ℃溫育過(guò)夜，將第二抗體溫育1 h，然后顯影并暴露。抗體使用稀釋比分別為：DJ-1 1∶1 000，TH蛋白抗體 1∶2 000，β-actin 1∶2 000。

1.8熒光定量PCR用不同濃度的H2O2處理PC12細(xì)胞3 h后，提取總RNA，用TAKARA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將500 ng總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。稀釋5倍后用熒光定量 PCR檢測(cè)。所用PCR引物如為，DJ-1正向引物：5′-GGTCCTACTGCTCTGTTG-3′，DJ-1反向引物：5′-GTTGTGACTTCCA-TACTTCC-3′；Caspase-3正向引物：5′-AGAGCTGGACTGCGGTATTGAG-3′，Caspase-3反向引物：5′-GAACCATGACCCGTCCCTTG-3′；α-synuclein正向引物：5′-CCTCAGCCCAGAGCCTTTC-3′，α-synuclein反向引物：5′-CCTCTGCCACACCCTGCTT-3′；Bax正向引物：5′-ACACCTGAGCTGACCTTGGA-3′，Bax反向引物：5′-CCGTGTCCACGTCAGCAATC-3；Bcl-2正向引物：5′-AAGCTGTCACAGAGGGGCTA-3′，Bcl-2反向引物：5′-GACGGTAGCGACGAGAGAAG-3′；p53正向引物：5′-GTACCGTATGAGCCACCTGAG-3′，p53反向引物：5′-CGTCCCAGAAGATTCCCAC-3′；β-actin (內(nèi)參)正向引物：5′-AGAAAATCTGGCACCACACC-3′，β-actin (內(nèi)參)反向引物：5′-CTCCTTAATGTCACGCACGA-3′。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)由SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。通過(guò)單因素方差分析(ANOVA)分析組間比較的結(jié)果，并通過(guò)SNK-q檢驗(yàn)進(jìn)行兩組之間的比較。以P<0.05被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1H2O2對(duì)PC12細(xì)胞增殖活性的影響分別用不同濃度的H2O2處理PC12細(xì)胞1.5 h和3 h，用CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖活性。結(jié)果如圖1所示，PC12細(xì)胞的活性隨H2O2濃度的升高逐漸降低。當(dāng)H2O2濃度大于100 μmol·L-1時(shí)，細(xì)胞活性低到一定水平繼續(xù)升高H2O2濃度對(duì)細(xì)胞活性的影響不大。

注：與0 μmol·L-1的H2O2處理1.5 h組相比較，aP<0.05

圖1H2O2處理對(duì)PC12細(xì)胞增殖活性影響

2.2H2O2處理對(duì)PC12細(xì)胞凋亡的影響用不同濃度H2O2處理PC12細(xì)胞24 h后，PI結(jié)果顯示，PI陽(yáng)性細(xì)胞的隨H2O2濃度的升高而增多，H2O2濃度大于100 μmol·L-1時(shí)，超過(guò)80%的細(xì)胞呈PI陽(yáng)性，即100 μmol·L-1H2O2可以引起大部分細(xì)胞發(fā)生凋亡。

2.3H2O2對(duì)DJ-1表達(dá)的影響TH蛋白是多巴胺合成的限速酶[11]，而PD的病理學(xué)特征之一是紋狀體多巴胺含量顯著減少，所以TH蛋白的表達(dá)量是PD的一個(gè)重要參數(shù)。Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，隨著H2O2處理濃度的升高，TH蛋白表達(dá)量逐漸減少(圖2)。

2.4過(guò)表達(dá)DJ-1對(duì)H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡的影響用pCDH1-cmv過(guò)表達(dá)載體表達(dá)DJ-1，轉(zhuǎn)染到PC12細(xì)胞中，pCDH1-cmv空載體組作為對(duì)照組，過(guò)表達(dá)DJ-1組作為實(shí)驗(yàn)組。用100 μmol·L-1的H2O2處理PC12細(xì)胞24 h，用PI/Hoechst染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果顯示相對(duì)于對(duì)照組，DJ-1組細(xì)胞的凋亡率降低超過(guò)50%，見(jiàn)圖3。

注：與對(duì)照組相同H2O2濃度相比較，aP<0.05

圖3DJ-1對(duì)H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響(DHE染色×100)

2.5過(guò)表達(dá)DJ-1對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響H2O2處理PC12細(xì)胞3h，pCDH1-cmv空載體組作為對(duì)照組，過(guò)表達(dá)DJ-1組作為實(shí)驗(yàn)組。細(xì)胞內(nèi)的ROS水平用DHE探針檢測(cè)。結(jié)果是經(jīng)過(guò)100μmol·L-1H2O2處理后，對(duì)照組ROS水平在上升。而在過(guò)表達(dá)DJ-1后，ROS上升卻受到了抑制，見(jiàn)圖4。

注：與對(duì)照組相同H2O2濃度相比較，aP<0.05

圖4DJ-1對(duì)H2O2細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響(DHE染色×100)

2.6過(guò)表達(dá)DJ-1對(duì)H2O2中凋亡基因表達(dá)的影響

pCDH1-cmv空載體作為對(duì)照組，過(guò)表達(dá)DJ-1作為實(shí)驗(yàn)組，用不同濃度的H2O2處理細(xì)胞3 h，并用RT-qPCR檢測(cè)相關(guān)基因的表達(dá)變化。結(jié)果顯示，隨著H2O2濃度的升高，α-synuclein的表達(dá)逐漸增加。同時(shí)凋亡相關(guān)基因Bax，p53和caspase-3的表達(dá)增加，而B(niǎo)cl-2的表達(dá)減少。這些基因的表達(dá)變化也許是細(xì)胞出現(xiàn)凋亡的主要原因。過(guò)表達(dá)DJ-1后，α-synuclein表達(dá)升高幅度變小。凋亡基因Bax，p53和caspase-3的表達(dá)不再隨H2O2濃度的升高而增加，H2O2對(duì)Bcl-2的下調(diào)作用也被減弱(圖5)。

3 討論

PD是一種神經(jīng)退行性疾病，其主要病理特征是紋狀體，尤其是黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元(DA)，它們是退行性缺陷。大量文獻(xiàn)證實(shí)，紋狀體中多巴胺及其代謝物的減少是由于TH的喪失引起的，導(dǎo)致一系列病理和臨床癥狀[12]。形態(tài)學(xué)研究報(bào)道了PD患者腦內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元凋亡的顯著變化[13-14]。目前PD黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元凋亡的一個(gè)重要因素被認(rèn)為是由氧化應(yīng)激引起的活性氧的增加[15-18]。研究表明，多巴胺類固醇和細(xì)胞毒性物質(zhì)如 H2O2和超氧化物是H2O2對(duì)多巴胺神經(jīng)細(xì)胞的損害[19]，在黑質(zhì)鐵離子催化下產(chǎn)生有毒的羥基受損細(xì)胞會(huì)使多巴胺能神經(jīng)元置于氧化應(yīng)激狀態(tài)[20]。DA本身還可以與谷胱甘肽結(jié)合形成谷胱甘肽-多巴胺，從而減弱PD患者腦內(nèi)的抗自由基能力，增強(qiáng)氧化應(yīng)激損傷作用[21];此外，由氧化應(yīng)激引起的DA神經(jīng)元中α-突觸核蛋白的異常修飾和聚集破壞了細(xì)胞內(nèi)DA的自我平衡[22]。DA的氧化產(chǎn)生細(xì)胞毒性物質(zhì)并且增加細(xì)胞自身的氧化應(yīng)激的損害。使得其持久損害神經(jīng)元[23]。

注：與0 μmol·L-1H2O2處理組相比較，aP<0.05

圖2Western blot檢測(cè)H2O2對(duì)DJ-1和TH蛋白表達(dá)的影響

注：與對(duì)照組相同H2O2濃度比較，aP<0.05

圖5RT-qPCR檢測(cè)DJ-1對(duì)H2O2中凋亡基因表達(dá)的影響

DJ-1基因位于人染色體1p36.26.3處，全長(zhǎng)是24 kb。有8個(gè)外顯子，其中外顯子1A和1B不參與蛋白質(zhì)的編碼，編碼DJ-1蛋白含有外顯子2-7[24]。研究表明， DJ-1可以控制多個(gè)抗凋亡的基因，除此之外，還發(fā)現(xiàn)在體內(nèi) DJ-1和體外 DJ-1，他們與 p53均相互作用影響， UV暴露條件下，過(guò)表達(dá) DJ-1能夠明顯抑制 p53的轉(zhuǎn)錄活性，這導(dǎo)致 Bax表達(dá)降低并且還抑制胱天蛋白酶-3活性，最終導(dǎo)致小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的凋亡[25]。另有研究表明， DJ-1在細(xì)胞內(nèi)外均具有與多個(gè)目的 RNA結(jié)合的能力，不乏包括 PTEN/ PI3 K通路上成員、線粒體基因以及谷胱甘肽代謝基因。在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，納摩爾濃度水平的DJ-1即可發(fā)揮上述作用，但有致病性的突變會(huì)使其失活，從而上述作用被抑制[26]。

在這里，神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)用于誘導(dǎo)PC12細(xì)胞進(jìn)入具有長(zhǎng)樹(shù)突的多巴胺能神經(jīng)元。建立了H2O2誘導(dǎo)的PDPC12細(xì)胞氧化應(yīng)急損傷模型。結(jié)果表明，H2O2可顯著抑制PC12細(xì)胞的增殖活性。 DHE染色顯示H2O2處理后 PC12細(xì)胞內(nèi) ROS水平顯著升高，在長(zhǎng)時(shí)間的H2O2處理后能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，即在H2O2的處理后可以造成 DJ-1蛋白和 TH蛋白的表達(dá)下調(diào)。過(guò)表達(dá)DJ-1后，PC12細(xì)胞對(duì)H2O2的耐受力升高，細(xì)胞內(nèi)的ROS升高受到抑制。DJ-1可以抑制α-突觸核蛋白的表達(dá)水平，而p53，Bax和caspase-3的表達(dá)水平受到抑制。Bcl-2的表達(dá)受到保護(hù)，這些功能可以減少細(xì)胞凋亡。這些結(jié)果表明， DJ-1可以通過(guò)調(diào)節(jié) p53， Bax， caspase-3和 Bcl-2的表達(dá)，調(diào)節(jié)細(xì)胞中的 ROS水平并減弱H2O2誘導(dǎo)的多巴胺神經(jīng)元中的氧化應(yīng)激損傷。本研究為PD的發(fā)病機(jī)制和臨床治療提供了新的靶點(diǎn)。這將帶來(lái)PD臨床治療的曙光。

(本文圖3,4見(jiàn)插圖12-1)