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        一測多評法測定白芍中的五種成分含量

        2018-11-19 07:11:00周光姣權(quán)春梅汪盈盈
        皖西學(xué)院學(xué)報(bào) 2018年5期
        關(guān)鍵詞:甲酰苯甲酸白芍

        周光姣,白 華,權(quán)春梅,汪盈盈,黃 翔

        (1.安徽中醫(yī)藥科學(xué)院 亳州中醫(yī)藥研究所,安徽 亳州 230031;2.亳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院,安徽 亳州 236800)

        中藥化學(xué)成分眾多、復(fù)雜,且中醫(yī)藥理論強(qiáng)調(diào)成分的整體協(xié)同作用,故對藥材及其制劑的質(zhì)量評價(jià)慢慢由單一成分評價(jià)轉(zhuǎn)向多指標(biāo)、整體性評價(jià)。一測多評法(QAMS)是利用樣品中物質(zhì)含量與檢測信號響應(yīng)值的比例關(guān)系,選擇并測定一個(gè)成分,以該成分作為內(nèi)參物,通過方法學(xué)考察,建立內(nèi)參物與其他物質(zhì)間的檢測響應(yīng)值比例關(guān)系即相對校正因子,利用相對校正因子換算其他物質(zhì)的含量,實(shí)現(xiàn)對其中多個(gè)成分含量的測定[1-3]。一測多評法可以實(shí)現(xiàn)多種成分的同步測定,提高工作效率,還可以解決缺乏對照品的問題,能夠最大限度降低檢驗(yàn)成本。

        白芍為毛茛科植物芍藥(Paeonia lactiflora Pall)的干燥根,性微寒,味微苦、酸。具有養(yǎng)血調(diào)經(jīng)、柔肝止痛、斂陰止汗等功效,臨床上廣泛應(yīng)用[4]。白芍主產(chǎn)于安徽、浙江、四川等地,其中安徽亳州種植面積最大,產(chǎn)量最大,也是白芍的地道產(chǎn)地。目前,對白芍中的化學(xué)成分和含量測定方法已研究較多,但運(yùn)用一測多評法研究、評價(jià)白芍的質(zhì)量相對較少[5]。本課題采用一測多評的質(zhì)量評價(jià)模式,以芍藥苷為內(nèi)參物,利用相對校正因子計(jì)算白芍中沒食子酸、苯甲酸、苯甲酰芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷的含量,以更簡單的方法,多指標(biāo)評價(jià)白芍的質(zhì)量,使其更加合理、可行。

        1 儀器設(shè)備與材料

        1.1 儀器設(shè)備

        Agilent1260型高效液相色譜儀(美國安捷倫科技有限公司);Agilent ChemStation工作站;島津 LC-20A 高效液相色譜儀,Lab solution工作站;Thermo ODS C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)、安捷倫ZORBAXSBC18(4.6×250 mm,5 μm)色譜柱;FA2204電子天平(常州市幸運(yùn)電子設(shè)備有限公司)等。

        1.2 材料

        樣品:實(shí)驗(yàn)用藥材樣品為課題組成員分別從安徽、浙江、四川白芍主產(chǎn)區(qū)采集,經(jīng)亳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)院陳娜副教授鑒定為毛茛科植物芍藥(Paeonia lactiflora Pall)的根。具體信息見表1。

        對照品:沒食子酸對照品(批號:1110831-201204))、芍藥苷對照品(批號:110736-201640)、苯甲酸對照品(批號:100419-201502),購自中國藥品生物制品研究院;芍藥內(nèi)酯苷對照品(批號:17022404)、苯甲酰芍藥苷對照品(批號:20140419)購自成都普菲德生物技術(shù)有限公司。

        試劑:甲醇、乙腈為色譜純,其他試劑均為分析純。

        2 方法與結(jié)果

        2.1 HPLC色譜條件

        采用安捷倫ZORBAXSBC18(4.6×250 mm,5 μm)色譜柱,以乙腈(A)-0.1%磷酸水(B)為流動(dòng)相,梯度洗脫,洗脫程序見表2。進(jìn)樣量10 μL,柱溫28 ℃,流速1.0 ml/min,檢測波長為230 nm。

        表1 藥材樣品信息表(n=6)

        表2 洗脫程序

        此色譜條件下沒食子酸、苯甲酰芍藥苷、芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷和苯甲酸分離效果較好,理論塔板數(shù)不低于4000。結(jié)果見圖1。

        2.2 樣品溶液的制備

        稱取白芍樣品1 g,粉碎過2號篩,精密稱定,加入20 mL 70%乙醇回流提取2次,每次2 h,合并濾液,70%乙醇定容至100 mL,搖勻,微孔濾膜濾過,即得樣品溶液。

        2.3 對照品溶液的制備

        精密稱定芍藥內(nèi)酯苷對照品13.75 mg、芍藥苷對照品22.21 mg、苯甲酰芍藥苷對照品10.64 mg和苯甲酸對照品6.6 mg、精密移取沒食子酸母液(精密稱定沒食子酸對照品15.88 mg,甲醇溶解并定容至10 mL,搖勻作為沒食子酸母液)2.5 mL至50 mL量瓶中,加甲醇溶解并定容至刻度50 mL,得到芍藥內(nèi)酯苷濃度為275 μg/mL、芍藥苷濃度為444.2 μg/mL、苯甲酰芍藥苷212.8 μg/mL、苯甲酸132 μg/mL、沒食子酸濃度為79.4 μg/mL的混合對照品溶液。

        2.4 方法學(xué)考察

        2.4.1 線性關(guān)系的考察

        精密移取上述混合對照品溶液0.5 mL、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL分別至10 mL容量瓶中,甲醇定容至刻度,制成不同濃度的對照品溶液。按2.1項(xiàng)下色譜條件,分別進(jìn)樣,記錄峰面積。以對照品的質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo),峰面積(Y)為縱坐標(biāo),線性回歸,得回歸方程見表3。

        1.沒食子酸 2.芍藥內(nèi)酯苷 3.芍藥苷 4.苯甲酸 5.苯甲酰芍藥苷圖1 白芍樣品和混合對照品的HPLC圖

        成分回歸方程r線性范圍μg/mL沒食子酸y=19.018x+45.5220.99983.97~39.7芍藥苷y=3.4082x+37.8910.999622.21~222.1芍藥內(nèi)酯苷y=1.8036x+25.2480.9998 13.75~137.5苯甲酰芍藥苷y=4.6754x-10.0720.9994 10.64~106.4苯甲酸y=25.378x+15.142 0.99966.6~66

        2.4.2 精密度實(shí)驗(yàn)

        稱取安徽亳州十八里鎮(zhèn)白芍樣品1.0 g,按分2.2項(xiàng)下制備樣品溶液,精密吸取樣品溶液10 μL。按上述色譜條件,進(jìn)樣,測定峰面積,重復(fù)6次。分別記錄沒食子酸、芍藥內(nèi)酯苷、苯甲酸、苯甲酰芍藥苷和芍藥苷的6次峰面積,計(jì)算其RSD分別為1.32%、1.78%、1.41%、0.93%、1.48%,結(jié)果表明所使用設(shè)備精密度較好。

        2.4.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

        分別取安徽亳州十八里鎮(zhèn)的白芍樣品6份,按2.2項(xiàng)下制備樣品溶液,按上述色譜條件,測定苯甲酰芍藥苷、苯甲酸、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷和沒食子酸的含量,計(jì)算RSD分別為1.21%、1.58%、1.31%、0.98%、1.07%,均小于2%,表示該方法重復(fù)性較好。

        2.4.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

        取十八里鎮(zhèn)的白芍樣品按2.2項(xiàng)下制備樣品溶液,按上述色譜條件,分別于0、3、6、9、12、18、24、48h進(jìn)樣。記錄苯甲酰芍藥苷、芍藥苷、苯甲酸、芍藥內(nèi)酯苷和沒食子酸的峰面積,算得RSD分別為1.19%、0.82%、1.22%、1.81%、1.73%,均小于2%,表明樣品溶液在48 h內(nèi)能夠穩(wěn)定存在。

        2.4.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

        取已知樣品含量的白芍樣品6份(苯甲酸芍藥苷含量為0.138%、沒食子酸含量為0.279%、苯甲酸含量為0.117%、芍藥苷含量為1.615%、芍藥內(nèi)酯苷含量為0.549%),粉碎,過2號篩,每份取0.5 g,精密稱定,分別按80%、100%、120% 三個(gè)水平,加入苯甲酸、芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、苯甲酰芍藥苷和沒食子酸5種對照品。按2.2項(xiàng)下制備樣品溶液,按上述色譜條件測定含量,計(jì)算加樣回收率。結(jié)果苯甲酸芍藥苷、沒食子酸、苯甲酸、芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷苷的加樣回收率分別為101.5%、100. 4%、98.84%、99.27%和101.2%,RSD值分別為1.89%、1.72%、1.28%、0.84%和1.06%。

        2.4.6 相對校正因子(RCF)和相對保留時(shí)間(RRT)的測定

        取“2.2”項(xiàng)下混合對照品溶液1 mL,至10 mL容量瓶中,甲醇稀釋至刻度,分別吸取10、20、30、40、50 μL按“2. 1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣,測定沒食子酸、芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、苯甲酸和苯甲酰芍藥苷峰面積。以芍藥苷為內(nèi)參物,計(jì)算沒食子酸(X1)、芍藥內(nèi)酯苷(X2)、苯甲酸(X3)和苯甲酰芍藥苷(X4)的相對校正因子(RCF)和相對保留時(shí)間(RRT),結(jié)果見表4。表明使用不同色譜柱和不同高效液相色譜儀,各成分相對于芍藥苷的 RCF 值和 RRT 值的 RSD 均小于 5.0%,說明該方法重現(xiàn)性較好。

        表4 白芍藥材中 4種成分的RCF和RRT(n=3)

        2.5 QAMS法和外標(biāo)法5種成分含量測定結(jié)果和比較

        分別取白芍樣品約1g,粉碎,過2號篩,精密稱定。分別按2.2項(xiàng)制備方法制備樣品溶液,按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析,采用外標(biāo)法和QAMS算出各白芍藥材中5種含量,結(jié)果見表5。

        結(jié)果表明:QAMS法和外標(biāo)法測定各批樣品中沒食子酸、芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、苯甲酰芍藥苷和苯甲酸5種成分含量結(jié)果相對誤差很小,均小于5%,表明兩種方法所測得含量無顯著差異。

        3 討論

        從表3方法耐用性考察結(jié)果可以看出,內(nèi)參物芍藥苷與沒食子酸、芍藥內(nèi)酯苷、苯甲酰芍藥苷和苯甲酸4種成分之間的相對校正因子重現(xiàn)性良好,說明QAMS法用于測定亳白芍中的5種成分,系統(tǒng)適用性強(qiáng),方法具有可行性和可靠性。

        白芍樣品的制備時(shí),預(yù)實(shí)驗(yàn)是分別摸索了回流提取和超聲提取兩種方法,并篩選了提取溶媒,結(jié)果發(fā)現(xiàn)超聲提取較回流提取工藝簡單,節(jié)省時(shí)間和耗材,但所得提取液相色譜出峰數(shù)多、分離度不好,故選擇回流提取。在選擇40%、70%和80%三個(gè)濃度的乙醇做提取溶劑時(shí),實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)40%乙醇5種成分的含量都偏低,70%、80%的乙醇,結(jié)果差異不大,但從節(jié)省資源的角度,優(yōu)選70%的乙醇做最后的提取溶劑。

        表5 QAMS法和外標(biāo)法測定藥亳白芍材中5種成分含量結(jié)果及比較(%,n=3)

        白芍藥材5種成分檢測,一測多評法代替?zhèn)鹘y(tǒng)的外標(biāo)法,在沒食子酸、芍藥內(nèi)酯苷、苯甲酰芍藥苷和苯甲酸對照品缺乏的情況下可以實(shí)現(xiàn)多成分的檢測,同時(shí)還節(jié)約了檢測成本,值得推廣應(yīng)用。

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